Advance in the research of factors associated with cell apoptosis due to influenza virus infection.
YANG Jian-lin，FAN Xiao-hui.
（Postgraduate of Microbiology of Guangxi Medical Universiy，Nanning530021， Guangxi，P.R.China）
10年前，人们对流感病毒的研究中，发现这种病毒在体内和体外均可引起细胞凋亡，对流感病毒诱导细胞凋亡的研究不但有利于深入了解流感病毒致病机制，而且为运用生物学方法治疗恶性肿瘤提示新的线索。现对流感病毒感染与细胞凋亡关系的研究进展进行综述。
1 流感病毒感染诱导宿主细胞凋亡
1993年，Takizawa ［1］ 等发现，体外培养的狗肾细胞系（Medin-Darby canine kidney，MDCK）和人宫颈癌Hela细胞感染人A型流感病毒后，细胞出现染色体浓缩、凝聚，凋亡小体形成，DNA电泳呈典型“阶梯状”条带等一系列凋亡特有的变化，从而第一次提出流感病毒可诱导体外培养细胞发生凋亡。随后，又有报道流感病毒能诱导小鼠气管、支气管上皮细胞、肺泡及淋巴细胞凋亡的发生 ［2］ 以及鸡体内细胞凋亡的出现 ［3］ 。随着研究的深入，Hinshaw ［4］ 等人发现各类A流感病毒（鸟，人，猪，马）以及B类流感病毒都能够引起细胞DNA断裂。他们用人类的凋亡阻滞剂bc1-2基因转染MDCK细胞后，病毒同时感染转染细胞和未转染细胞，发现转染细胞不会出现凋亡而且活性检测明显高于未转染的MDCK细胞。这些结果进一步证明了诱导凋亡是流感病毒引起细胞死亡的机制之一。
实验证明，紫外线、药物灭活的病毒不能诱导细胞凋亡，说明病毒诱导细胞凋亡与病毒复制增殖相关联。流感病毒诱导细胞凋亡的机制尚未完全清楚，目前研究显示有宿主细胞和病毒自身两方面的因素。
2 流感病毒诱导细胞凋亡的细胞因素
2.1 Fas/FasL诱导机制 Fas胞外区与其相应的受体Fas Lig-and（FasL）结合后，其胞内区可结合一大类死亡凋变分子，引起Fas相关死亡功能域（Fas-associated death domain-containing protein，FADD）和caspase-8的聚集，它们能够使下游的Caspase水解活化，从而诱导细胞凋亡。
流感病毒感染细胞后，细胞内Fas的mRNA水平明显提高，细胞表面的Fas表达上调，进而诱导细胞凋亡的发生。对于Fas基因的启动和表达增强，目前的研究表明可能与以下的几种机制有关:①双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）:dsRNA是病毒复制的中间产物，它可诱导细胞Fas mRNA，进而上调细胞表面Fas表达。②双链RNA激活蛋白激酶R（dsRNA-activated protein kinase R，PKR）和干扰素（Interferon，IFN）:病毒感染细胞后，刺激细胞产生IFN，IFN可诱导PKR的合成，同时增强PKR的活性;PKR与dsRNA结合发生自身磷酸化，活化 Fas的基因表达。Balachdran ［5］ 等还发现，高表达PKR的细胞对dsRNA诱导的凋亡非常敏感，一方面PKR活化可促进Fas的生成以及FADD的活化，诱导凋亡;另一方面，Fas高表达和FADD激活的死亡信号反作用于PKR，更加强PKR的活性，促进细胞凋亡发生。3.白介素-6表达核因子（nuclear factor for inter-leukin-6expression，NF-IL6）:实验证明流感病毒感染后NF-IL6活性增强，Fas mRNA水平升高，且两者变化过程一致，都可以被anti-NF-IL6抑制 ［6］ ，同时DNA序列分析表明NF-IL6可能是细胞内Fas基因启动子激活的调节因子。因此，人们推测病毒感染细胞后，活化的NF-IL6与Fas基因启动区结合位点结合，增强Fas基因转录活性，导致细胞大量表达Fas。
2.2 活化的转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导凋亡 TGF-β是一种具有多种生物学功能的生长调节蛋白，活化后可诱导细胞凋亡。Stacey ［7］ 等报道，流感病毒NA具有唾液酸酶的作用，病毒感染细胞后，NA裂解TGF-β前体LAP（latency-associated peptide）上的唾液酸残基，释放成熟的TGF-β，使得细胞表面或细胞外基质中TGF-β的活性增强，造成细胞凋亡的发生。
2.3 IFN与病毒诱导细胞凋亡的关系 众所周知IFN具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调节的作用。诱导细胞凋亡是宿主限制病毒生长，抑制病毒扩散的主要机制。IFN造成细胞凋亡最主要的作用方式是通过激活PKR，高表达Fas来实现的。Zhirnov等 ［8］ 实验证明，病毒对IFN合成功能不同的细胞诱导凋亡的效应明显不同。在能产生IFN的细胞（MDCK细胞、鸡成纤维细胞等）凋亡发生迅速且严重，在Vero细胞这种IFN合成缺陷的细胞中，细胞凋亡则延迟发生。因此推测，病毒诱导细胞凋亡机制与IFN抗病毒作用机制相关联。例如，通过eIF2阻止细胞蛋白质合成，Oligoadenylate合成酶水解RNA等方式诱导细胞凋亡，从而抑制病毒复制增殖。此外，还发现流感病毒蛋白NS1诱导细胞凋亡作用也依赖IFN。缺乏功能性IFN的级联反应，诱导凋亡的作用下降，感染细胞中某些抑制凋亡的调控作用失效，细胞凋亡延迟发生。
2.4 肿瘤抑制蛋白p53的重要地位 通常情况下，p53是机体应激反应的重要组成部分，阻止受损细胞和异常细胞的生长繁殖 ［9］ 。小鼠感染流感病毒后，肺组织中p53水平明显增加，提示病毒感染可能增加p53基因的转录活性，诱导基因产物p53的合成 ［10］ 。为了证实p53在流感病毒诱导细胞凋亡中的作用，Elizabet ［11］ 等用流感病毒感染人肺支气管上皮细胞、人肺A549细胞、野生型鼠胚胎成纤维细胞以及p53缺失型鼠胚胎成纤维细胞。检测各种细胞中p53的活性、含量和细胞凋亡状态。结果显示流感病毒感染后，细胞中p53基因转录活性增强，高表达p53，诱导细胞凋亡。而p53缺失或p53突变的细胞株在病毒的感染下却没有出现细胞凋亡。因此认为p53也是流感病毒诱导细胞凋亡的重要因素之一。
2.5 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL） 我们已知TRAIL能够诱导各种肿瘤细胞凋亡，对正常细胞无作用，体内正常细胞TRAIL受体表达模式具有抵抗TRAIL介导凋亡的作用。然而，流感病毒感染可以改变其表达，提高细胞对TRAIL介导凋亡的敏感性。Ishikama ［12］ 等用流感病毒感染小鼠后，小鼠体内TRAIL mRNA表达明显增加。病毒感染4～7d，小鼠肺NK细胞、CD4+、CD8+T细胞高表达TRAIL蛋白及其受体DR5，肺组织感染细胞出现凋亡。而未感染病毒的小鼠肺T、NK细胞表面均未检测到TRAIL蛋白。病毒感染6wk后，TRAIL和DR5的合成减少到正常水平，小鼠肺组织细胞的死亡现象亦减少至消失。运用TRAIL单克隆抗体作用感染小鼠，与其细胞表面的TRAIL结合，发现明显延迟小鼠肺组织感染细胞的死亡。
2.6 其他因素 ①转录因子-NF-KB:Wurzer ［13］ 等证实，一方面，NF-KB被dsRNA活化后，诱导IFN-β转录表达，发挥抗病毒作用，并且上调死亡诱导信号CD95及其受体的表达，促进细胞凋亡。另一方面，又可以促进抗凋亡蛋白的基因表达，例如，Bcl-XL、细胞产生的凋亡蛋白阻滞剂等，抑制细胞凋亡的发生。即NF-KB通过控制多种抗病毒细胞因子和炎症反应因子的基因表达，对凋亡有双重调控作用。②c-Jun N-termi-nal kinase（JNK）and p38mitogen-activated protein kinase（MAPK）:Mori ［14］ 用流感病毒感染小鼠脑组织时发现，感染的神经细胞中JNK信号转化途径被激活，细胞出现典型凋亡形态变化。病毒感染神经细胞中MAPK也被广泛活化，虽然没有显示MAPK与细胞凋亡有直接联系，但是，活化的MAPK与IFN-α的合成有关，间接参与细胞凋亡的调节。③凋亡和炎症介质的释放:病毒感染细胞释放的IL-1α/β和CXCL8是诱导细胞凋亡的因素之一，细胞内的这些细胞因子聚集，在Caspase-1的作用下活化引起凋亡，流感病毒感染巨噬细胞、呼吸道上皮细胞等都能观察到这样的现象 ［15］ 。
3 流感病毒诱导细胞凋亡的病毒因素
3.1 NS1的作用 NS1诱导细胞凋亡:Stacey ［16］ 等人将病毒完整NS基因转染到MDCK细胞及HeLa细胞，Western blot分析法显示，数小时后，细胞中均出现DNA裂解片段，提示NS可诱导细胞的凋亡。进一步研究发现，单独NS1基因就可以诱导MD-CK细胞凋亡。用不同功能区突变或缺失的NS1基因转染MD-CK细胞，发现RNA相关功能区突变时，细胞中无DNA裂解片段的出现，提示RNA相关功能区是NS1诱导MDCK细胞凋亡中必需的因素之一。Zhirnov ［8］ 等对缺乏NS1基因的流感病毒株和野生病毒株研究显示，NS1基因缺失病毒对能合成IFN的MDCK细胞、鸡成纤维细胞可诱导凋亡，而且发生速度及严重程度都高于野生病毒株;但是在无IFN合成的Vero细胞中，则不能诱导细胞凋亡的出现。推测NS1以依赖IFN的方式调控感染细胞的凋亡。NS1可能有一些特殊的靶点在IFN级联反应中，例如，PKR，IRF3，NF-kβ等与凋亡的调控相关。 NS1抑制细胞凋亡:NS1通过与dsRNA结合，抑制dsRNA介导的NF-Kβ的活化及IFN-β的合成，阻止PKR的活化 ［17］ 。进而抑制细胞凋亡发生。Stasakova ［18］ 等实验证实，缺乏N基末端功能区的NS1蛋白能够增强Caspase-1的活性，诱导巨噬细胞发生迅速而严重的凋亡，推测NS1的N基末端功能区能够通过抑制Caspase-1的活性，阻止细胞凋亡的发生。
3.2 NA诱导凋亡 以往研究已知，TGF-β诱导细胞凋亡的活性可被抗NA抗体抑制，Morris ［19］ 通过用三种抗NA抗体作用于流感病毒，证明抗NA抗体能减轻流感病毒诱导MDCK细胞凋亡程度。同位素GG167示踪法显示，抗NA抗体不能进入细胞内部，说明其对NA的抑制作用也是在细胞表面实现的。推测其作用靶点是TGF-β。即NA通过活化TGF-β间接诱导凋亡。将抗TGF-β作用于反应体系，并没有完全阻止细胞凋亡的出现，提示NA还有直接诱导凋亡的作用。为取得更加直接的证据支持NA具有不依赖TGF-β，以病毒蛋白作用诱导细胞发生凋亡，Morris ［20］ 等将流感病毒NA融合在单纯疱疹病毒衣壳蛋白VP22上，然后转染到HeLa细胞中，实验表明NA融合的VP22能诱导HeLa细胞发生凋亡，证实在没有TGF-β的作用下，NA具有直接诱导细胞凋亡的能力。实验还显示这种融合蛋白有抑制dsRNA诱导凋亡的作用，提示NA有双重的作用方式。
3.3 PB1-F2的作用 Chanturiya ［21］ 等发现，A型流感病毒PB1基因的一个移码区编码的一种线粒体蛋白PB1-F2能诱导细胞死亡。实验显示PB1-F2在导电的环境下降低了双分子膜的稳定性，同时减少了脂质小孔的膜张力，经过PB1-F2处理的细胞膜可以允许单价阳离子、氯化物、二价离子等结构通过。用一系列物理和电生理的技术方法，证实人工合成的PB1-F2能够形成不同形式的离子通道，增加细胞膜的通透性。以绿色荧光素标记PB1-F2蛋白，证实了PB1-F2定位在细胞线粒体膜上，并显示了其两性化分子α-螺旋结构，可以诱导表达chimeric蛋白的细胞发生凋亡。由此推测，PB1-F2诱导细胞死亡的基础可能是引起线粒体膜的不稳定，形成凋亡小孔，增加其渗透性，导致大量渗漏造成的。通过对PB1-F2和磷脂双分子膜相互作用的研究，证实了PB1-F2同其它前凋亡蛋白功能相一致。最终认为，流感病毒感染细胞后合成PB1-F2，表达在病毒感染细胞的线粒体上，和线粒体膜脂质结合组成凋亡小孔，导致一些大分子如细胞色素C通过，从而活化Caspase级联反应，引起细胞凋亡。
3.4 其它病毒蛋白 流感病毒诱导细胞凋亡是个复杂的过程，不仅有上述病毒蛋白发挥作用，还有其它病毒蛋白的联合效应，共同造成宿主抗凋亡和凋亡平衡的紊乱，引发凋亡。例如，M1蛋白干扰Caspase系统活化，有抗凋亡的作用，M2蛋白引起Caspase裂解活化，诱导凋亡发生。
4 结语
综上所述，流感病毒感染造成细胞凋亡因素繁多，过程复杂。许多因素具有双重调控作用。整个过程由多种细胞因子及病毒蛋白协同作用完成。但各种因素在诱导凋亡过程中的作用途径、相互作用方式、发挥作用的环境等等还未完全清楚，有待进一步研究。
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