摘要:目的 探讨慢性活动性乙型肝炎（CAHB）患者外周血活化抗原CD69、HLA-DR分子在T细胞表达的变化及其意义。 方法 以31例正常人作为对照，采用免疫荧光三色标记流式细胞术，检测30例CAHB患者外周血T细胞亚群及其CD69、HLA-DR抗原表达;同时用荧光定量PCR检测患者的病毒DNA载量。 结果 CAHB患者外周血CD3 + T细胞的百分率（63.78%±9.70%）与正常对照组比较差异有显著性（P<0.01），CD4 + T细胞的百分率（45.88%±8.51%）明显低于正常对照组（P<0.001），CD8 + T细胞的百分率（44.64%±7.10%）明显高于正常对照组（P<0.001）;CD3 + T细胞CD69的表达（6.85%±2.83%）与正常人对照组比较差异也有显著性（P<0.01），其中CD4 + T细胞CD69的表达（2.31%±0.94%）与正常对照组比较差异无显著（P>0.05），CD8 + T细胞表达CD69水平（3.87%±1.81%）明显高于对照组（P<0.01）;CD3 + T细胞上HLA-DR的表达（17.09%±4.23%）与正常对照组之间差异有显著性（P<0.001），其中CD4 + T细胞中HLA-DR + 细胞（7.97%±2.43%）和CD8 + T细胞中HLA-DR + 细胞（5.52%±1.48%）均比正常对照组显著增高（P<0.01）（P<0.001）;CD8 + CD69 + 、CD8 + HLA-DR + 细胞的数量与病毒DNA载量之间呈正相关。 结论 CAHB患者存在细胞免疫功能紊乱和淋巴细胞异常激活现象，T淋巴细胞的激活以CD8+T细胞为主，其在抗病毒感染中起着重要作用。
关键词:慢性;乙型肝炎;T淋巴细胞;CD69;HLA-DR
The expression of activated antigens in peripheral blood T lymphocyte subsets in patients with chronic active hepatitis B.
ZHANG Ming-xia，LIN Li-hang，WANG Hui.
（Department of Central Laboratory of Shenzhen Municipal Hospital of Chronic Diseases，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To investigate the expression of special marker for activation of peripheral blood T lymphocytes in patients with chronic hepatitis B virus and its significance. Methods Immunofluorescent three-color flow cytometry was used to study the expression of CD69and HLA-DR on T lymphocytes in30patients with chronic active hepatitis B virus and31normal controls.The viral load was determined by fluorescence quantitative PCR. Results Expression of CD3 + T cells were significantly lower in pa-tients（63.78%±9.70%）than that in controls（P<0.01），meanwhile the expression of CD4 + T cells was45.88%±8.51%，significantly lower than that of the controls（P<0.001）and the expression of CD8 + T cell was44.64%±7.10%，significantly higher than that of the controls（P<0.001）.Detection of CD69on CD3 + T cells in patients was6.85%±2.83%，significantly higherthan that of the controls（P<0.01）.NO significant difference in the expression of CD69on CD4 + T cells was observed be-tween patients and the controls（P>0.05），and the expression of CD69on CD8 + T cells was3.87%±1.81%，significantly dif-ferent from that of the controls（P<0.01）.The expression of HLA-DR on CD3 + T cells were significance difference between pa-tients（17.09%±4.23%）and that in controls（P<0.001）.The percentages of CD4 + T cells expressing HLA-DR in patients was7.97%±2.43%，significantly higher than that of the controls（P<0.01）.Significant difference was observed in the expression of HLA-DR on CD8 + T cells in patients（5.52%±1.48%）as compared with controls（P<0.001）.There were positive correlations between percentages of CD8 + CD69 + ，CD8 + HLA-DR+cells and viral load. Conclusion The findings support that cellular immunodeficiency exists in patients and that T lymphocytes were abnormally activated in the patients.The activation of peripheral blood T lymphocytes in patients mainly involves CD8+subset and it may play an important role in the immune response to antiviral infection.
Key words:Chronic，Hepatitis B;T-lymphocytes;CD69;HLA-DR
乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝DNA病毒，主要侵犯肝脏并在肝细胞内复制，但对肝细胞无明显杀伤作用，当机体针对HBV产生免疫反应时，才会引起肝脏病变。细胞免疫在乙型肝炎发生、发展过程中发挥着重要作用，机体细胞免疫状态的不同会导致不同的临床结果出现 ［1］ 。此外，Rehermann ［2］ 研究 发现HBV病毒感染可使机体免疫细胞异常激活和功能紊乱。T细胞是细胞免疫功能的主要执行者，包括CD4 + T细胞和CD8 + T细胞，目前国内外有关T细胞亚群活化抗原的研究在乙型肝炎发病中的报道较少。为了探讨T细胞及其亚群的激活在CAHB发病机制中的作用，现采用免疫荧光三色标记流式细胞术检测30例CAHB患者外周血早期活化抗原CD69和晚期活化抗原HLA-DR在T细胞上表达的变化，并分析其意义。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象 依据2000年中华医学会传染病与寄生虫病学会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎的诊断标准 ［3］ 确诊的30例患者，其中男23例，女7例，平均年龄34.8岁（20～58岁），所有患者的HBV血清标志物（HBsAg、HbeAg、抗HBc）均呈阳性，血清HBV DNA定量>1×10 8 拷贝/L，丙氨酸转移酶（ALT）异常>正常3倍以上，检测前1月未使用过糖皮质激素类药物或其他影响免疫功能的药物治疗;正常人31例，其中男21例，女10例;平均年龄33.6岁（19～56岁），均排除有慢性传染性疾病或感染性疾病，HBsAg阴性及丙氨酸转移酶正常。
1.1.2 试剂及仪器 三色荧光标记单克隆抗体CD8FITC/CD69PE/CD3PerCP，CD4FITC/CD69PE/CD3PerCP和阴性同型对照γ 1 FITC/γ 1 PE/CD3PerCP以及CD3PerCP，红细胞裂解液为BD FACS TM Lysing solution以上产品均购自美国Becton Dickinson公司，HLA-DR-FITC、CD4-PCY5、CD8-PCY5单抗和同型对照IgG2b为法国Immunotech公司产品。FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司生产。HBV核酸扩增荧光定量PCR试剂盒为深圳匹基生物工程股份有限公司产品，PCR仪为Roche公司的light cycler荧光定量核酸检测仪。
1.2 方法
1.2.1 标本收集 取患者及正常人静脉血5ml，分两管，一管用肝素抗凝，用于流式细胞检测，另一管不加抗凝剂，分离血清后用于肝功能和HBV-DNA病毒载量测定。
1.2.2 流式细胞术检测外周血T淋巴细胞及其活化抗原 肝素抗凝血分装6管，每管加100μl全血，再分别加入10μl上述三种三色荧光标记单抗试剂以及CD4-PCY5、CD8-PCY5、CD3PerCP和HLA-DR FITC单抗及同型对照IgG2b，4℃避光孵育20min，加红细胞溶解液2ml混匀，室温放置5min，离心弃上清，用PBS洗涤2次，将细胞重悬于1%多聚甲醛固定液500μl中，用FACSCalibur流式细胞仪CellQuest软件获取收集30000个细胞/管，用前向散射角（FCS）及侧向散射角（SSC）确定淋巴细胞群再以PerCP标记CD3 + 的细胞射门并分析数据，以荧光抗体染色阳性细胞占CD3 + T细胞的百分率记录结果。
1.2.3 病毒DNA载量检测 采用荧光实时定量PCR法，严格按操作说明书要求进行检测，将结果换算成对数值备用。
1.3 统计学分析 所有资料采用SPSS11.0统计软件进行分析，各组间比较取均数及标准差（x±s）进行t检验，各参数与病毒载量的相关性用Spearman相关分析。
2 结果
2.1 CAHB患者外周血T细胞亚群的分析 患者外周血CD3 + T细胞水平与正常对照组相比明显降低（P<0.01）;患者外周血CD3 + CD4 + T细胞水平显著低于正常对照组（P<0.001）;患者外周血CD3 + CD8 + T细胞水平显著高于正常对照组（P<0.001）。CD4 + T、CD8 + T的百分率与病毒DNA载量之间无相关性。结果见表1。
表1 CAHB患者外周血T淋巴细胞亚群的检测（略）
Tab1 Expression of T lymphocyte subsets on peripheral blood in patients
注:与对照组相比，※P<0.01;※※P<0.001。
Note:Compared with normal control group，※P<0.01;※※P<0.001。
2.2 CAHB患者T细胞上CD69表达 患者外周血CD3 + T细胞CD69的表达水平与正常人对照组比较差异有显著性（P<0.01），其中CD4 + T细胞CD69的表达水平与正常人对照组比较差异无显著性（P>0.05），CD8 + T细胞CD69的表达水平明显高于对照组（P<0.01）;相关分析发现，CD8 + CD69 + T细胞的表达水平与病毒DNA载量之间正相关（r=0.413，P<0.05），CD4 + CD69 + T细胞的表达水平与病毒DNA载量之间无相关性（r=0.095，P>0.05）。结果见表2、图1。
表2 CAHB患者外周血T细胞上CD69表达（略）
Tab2 Expression of CD69 + on peripheral blood lymphocytes in patients
注:与对照组相比，*P<0.01。
Note:Compared with normal control group，*P<0.01。
图1 CD8 + CD69 + T细胞表达与病毒DNA载量相关性分析（略）
Fig1 Analysis of correlations between the viral load and CD8 + CD69 + cells
2.3 CAHB患者T细胞上HLA-DR + 表达 CD3 + T细胞中HLA-DR + 细胞与正常人对照组之间差异有显著性（P<0.001），其中CD4 + T细胞HLA-DR + 的表达与正常人对照组之间差异有显著性（P<0.01），CD8 + T细胞中HLA-DR + 细胞比对照组显著增高（P<0.001）;相关分析发现CD8 + HLA-DR + 细胞的数量与病毒DNA载量之间正相关（r=0.536，P<0.01）CD4 + HLA-DR + 细胞的数量与病毒DNA载量之间无相关性（r=0.084，P>0.05）。结果见表3、图2。
表3 CAHB患者外周血T细胞上HLA-DR + 的表达（略）
Tab3 Expression of HLA-DR + on peripheral blood lymphocytes in patients
注:与对照组相比，※P<0.01;※※P<0.001。
Note:Compared with normal control group，※P<0.01;※※P<0.001。
图2 CD8 + HLA-DR + T细胞表达与病毒DNA载量相关性分析（略）
Fig2 Analysis of correlations between the viral load and CD8 + HLA-DR + T cells
3 讨论
人类正常的免疫过程有赖于免疫细胞，在各类病毒性肝炎中，T细胞在乙型肝炎病变过程中的作用最为明显，T细胞功能具有双重性，在清除病毒和控制病毒扩散的同时，也与病情的加重有关。Sing ［1］ 研究表明，各种乙型肝炎患者均存在不同程度的细胞免疫功能紊乱，其中T细胞亚群变化明显的是慢性活动性乙肝，表现为外周血CD4 + T细胞数量降低，CD8 + T数量增高，与本文检测的检测结果一致，说明慢性肝炎活动期随着肝脏病变加重，细胞免疫损伤严重，成熟T细胞遭到破坏，造成CD4 + T细胞数量减少，而CD8 + T细胞作为主要的免疫效应细胞数量的增加与病毒的清除有关，CD8 + T细胞在清除病毒的同时也造成肝细胞大量破坏，引起临床上血清ALT持续升高，患者症状加重。
CD69抗原又称早期激活抗原（EA-1），活化诱导分子（AIM），是表达于丝裂原或抗原刺激的各种激活T、B、NK细胞的最早期标志之一。在正常情况下外周血循环中极少有表达CD69的T细胞，但在特异性抗原或促有丝分裂原刺激下1～2h细胞表面CD69的表达即可测出并迅速达到高峰，表达可持续72h。CD69的功能是上调白介素2受体的p55链，产生Th1样细胞因子，引发淋巴细胞增殖，起信号传递功能 ［4］ 。Goncalves ［5］ 通过对HBV疫苗的研究发现T细胞CD69表达与HBV感染关系密切，认为T细胞CD69表达的降低是机体对HBV无反应的结果。以流式细胞仪分析30例CAHB患者外周血T淋巴细胞CD69抗原的表达，结果显示机体受到HBV感染后，特异性抗原的刺激使患者免疫系统发生反应性改变，T细 胞CD69表达增高。通过对患者T细胞亚群的研究发现，患者的CD8 + 杀伤性T细胞对HBV病毒的反应一直处于高水平激活状态，CD4 + 辅助性T细胞早期活化抗原处于低水平激活状态，机体通过活化及产生的特异性抗病毒的细胞毒性T细胞（CTL），从而达到清除病原体的目的。
人类主要组织相容性复合物（MHC）是人体细胞重要的表面抗原，而HLA-DR是MHC-Ⅱ类分子的主要抗原之一。正常情况下，它仅分布于B细胞、活化的T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和精子等，是免疫反应中重要的参与者，HLA-DR在免疫应答中的主要作用是与T细胞表面的CD4 + 分子和/或抗原结合，促进抗原传递，在抗原提呈中起着第一信号作用 ［6］ ，HLA-DR在静息的T细胞上表达很弱，T细胞激活时，其表达显著升高。与CD69抗原不同，HLA-DR激活标志在T细胞激活晚期表达且表达时间最长。实验发现患者组CD3 + 细胞HLA-DR表达增高，与蔡莉静结果一致 ［7］ ，进一步研究发现HLA-DR在CD4 + 、CD8 + T细胞中均显著增高，提示机体的免疫系统对病毒感染一直处于较高的应答状态，通过HLA-DR表达的增高，一方面调节机体免疫失调的状况，另一方面可能与乙肝的自身免疫反应有关 ［8］ 。相关分析发现CD8 + CD69 + T、CD8 + HLA-DR + T细胞的数量与病毒DNA载量呈正相关，可能是由于大量病毒抗原刺激机体免疫系统，机体试图通过异常激活CTL，使CTL活性增强发挥其杀伤功能，从而有助于病毒的清除。
观察T淋巴细胞表面分子及其不同亚群活化抗原的表达能较全面直观地了解机体的免疫状态。本文应用荧光三色流式细胞术通过对CAHB患者外周血T细胞及其活化抗原表达的检测，发现患者存在细胞免疫功能异常现象，尤其是CD8 + T细胞及其活化抗原的表达的增高表明它们在抗病毒感染过程中起重要作用，有关CD8 + T细胞活化抗原的表达能否反映病情及指导治疗有待临床进一步研究。
参考文献:
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