摘要:目的 研究海南省汉、黎族人群中东南亚型缺失（-- SEA ）、右侧缺失（-α 3.7 ）和左侧缺失（-α 4.2 ）三种α-地中海贫血缺失突变的携带率、基因频率及基因型的分布特点。 方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术直接筛查海南省汉、黎族人群中的东南亚型缺失（-- SEA ）、右侧缺失（-α 3.7 ）和左侧缺失（-α 4.2 ）三种α-地中海贫血缺失突变。 结果 在197例海南汉族人中检出25例α-地中海贫血携带者，携带率为12.69%;三种α-地中海贫血缺失突变的基因频率为0.0635，其中-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 的基因频率分别为0.0127、0.0305、0.0203，共发现-- SEA /αα、-α 3.7 /αα和-α 4.2 /αα三种基因型，其中-- SEA /αα5例，-α 3.7 /αα12例，-α 4.2 /αα8例。在201例海南黎族人中检出114例α-地中海贫血携带者，携带率为56.72%，三种α-地中海贫血缺失突变的基因频率为0.3607，其中-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 的基因频率分别为0.3607、0.0075、0.1891，共发现-- SEA /αα、-α 3.7 /αα、-α 3.7 /-α 3.7 、-α 3.7 /-α 4.2 、-α 4.2 /αα、和-α 4.2 /-α 4.2 六种基因型，其中-- SEA /αα3例，-α 3.7 /αα39例，-α 3.7 /-α 3.7 6例，-α 3.7 /-α 4.2 18例，-α 4.2 /αα38例，-α 4.2 /-α 4.2 10例。 结论 海南省汉、黎族人群是α-地中海贫血的高发群体。
关键词:地中海贫血;聚合酶链反应（PCR）;少数民族;海南省
Investigation into the deletion types ofα-thalassemia in Han and LI Nationalities in Hainan Province.
ZHOU Dai-feng，WANG Zheng，CAI Lan-jie，et al.
（Department of Biochemistry of Hainan Medical College，Haikou571101，Hainan，P.R.China）
Abstract:Objective To investigate the incidences、the allelic frequencies and the genotypes frequencies of threeα-tha-lassemia deletion types（-- SEA 、-α 3.7 、-α 4.2 ）and their distributions in Han and Li nationalities in Hainan Province. Methods Threeα-thalassemia deletion types，i.e Southeast Asia deletion（-- SEA ），right deletion（-α 3.7 ）and left deletion（-α 4.2 ），were screened based on polymerase chain reaction（PCR）in Han and Li nationalities in Hainan. Results 25carriers were detected in197Han individuals，and the incidence of carriers was12.69%.The gene frequency of these three deletion types was0.0127，0.0305and0.0203respectively，totally0.0635in Han nationality in Hainan.Three genotypes of5（-- SEA /αα）cases，12（-α 3.7 /αα）cases and8（-α 4.2 /αα）cases were detected.On the contrary，114carriers were detected from201individuals in Li nationality，and the incidence of carriers was56.72%.The gene frequency of these three deletion types was0.0075，01716and0.1891respec-tively，totally0.3607in Li nationality.Six genotypes were detected including3（-- SEA /αα）cases，39（-α 3.7 /αα）cases，6（-α 3.7 /-α 3.7 ）cases，18（-α 3.7 /-α 4.2 ）cases，38（-α 4.2 /αα）cases and10（-α 4.2 /-α 4.2 ）cases. Conclusion There is a high incidence ofα-thalassemia in Han and Li nationalities in Hainan province.
Key words:Thalassemia;Polymerase chain reaction（PCR）;Minority nationality;Hainan Province
α-地中海贫血（α-地贫）是一种严重危害人类健康的遗传病，其主要特征是α-珠蛋白链合成减少（α + 地贫）或缺如（α 0 地贫）。α-地贫分子缺陷有基因的大片段缺失和非缺失突变两大类 ［1］ ，α-珠蛋白基因缺失是导致α-地贫的主要原因。目前全世界已发现了35种α-珠蛋白基因缺失突变，在中国人中已发现7种，其中东南亚型缺失突变（-- SEA ）、右侧缺失型突变（-α 3.7 ）和左侧缺失型突变（-α 4.2 ）三种突变类型是我国南方最常见的缺失类型 ［2～4］ 。为了研究海南省汉、黎族人群中α-地中海贫血的发病率及其基因型的分布特点，我们应用聚合酶链反应（PCR）技术直接筛查197例海南汉族人和201例海南黎族人中的东南亚型缺失、右侧缺失和左侧缺失这三种最常见的缺失型α-地贫突变类型，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 DNA样品 用EDTA抗凝，采取海南省白沙、昌江、陵水、琼中、保亭等县正常体检、兵检和中小学生黎族人末梢血;采取海南省文昌市正常体检、兵检的海南籍汉族人群末梢血，按Lahiri等方法 ［5］ 提取DNA，阳性对照标本由南方医科大学医学遗传学教研室徐湘民教授惠赠。
1.2 PCR扩增 东南亚型缺失突变分析按文献 ［6］ 进行;右侧缺失型突变和左侧缺失型突变分析参照Amold S.-C.Tan ［7］ 等报道合成引物。扩增-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 的多重PCR体系均采用TaKaRa LA Taq TMJ 及缓冲液（宝生物工程有限公司产品），PCR反应体积为25μl，在PCR缓冲液（1×GC BufferⅡ，2.5mmol/L MgCl 2 ）中含模板DNA0.2μg，引物0.2～0.5μmol/L，dNTP为200μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，循环参数为99℃变性5min，85℃加酶，56℃退火1min，72℃延伸2min，然后95℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环后72℃延伸7min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在紫外光灯下观察结果并照相。
2 结果
2.1 -- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 缺失型突变的多重PCR扩增 在PCR反应体系中同时扩增了α2基因的一个1800bp的片段，用以判断样品DNA的α2基因是否缺失，从而判断α-地中海贫血突变患者是杂合子还是纯合子。无-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 缺失型突变的正常人DNA样品经PCR扩增后只出现一条1800bp的α2基因扩增片段;东南亚缺失型杂合子（-- SEA /αα）的DNA样品经PCR扩增后除出现一条1800bp的α2基因扩增片段外，还出现一条740bp的特异扩增片段;右侧缺失型杂合子（-α 3.7 /αα）的DNA样品经PCR扩增后除出现一条1800bp的α2基因扩增片段外，还出现一条2022bp的特异扩增片段;右侧缺失型纯合子（-α 3.7 /-α 3.7 ）的DNA样品经PCR扩增后只出现一条2022bp的特异扩增片段;左侧缺失型杂合子（-α 4.2 /αα）的DNA样品经PCR扩增后除出现一条1800bp的α2基因扩增片段外，还出现一条1628bp的特异扩增片段;左侧缺失型纯合子（-α 4.2 /-α 4.2 ）的DNA样品经PCR扩增后只出现一条1628bp的特异扩增片段;右侧缺失型并左侧缺失型双重杂合子（-α 3.7 /-α 4.2 ）的DNA样品经PCR扩增后同时出现2022bp和1628bp两条特异扩增片段。见图1。
图1 -- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 缺失型突变的多重PCR检测结果（略）
Fig1 The PCR-amplified result of-- SEA 、-α 3.7 、-α 4.2 deletion
注:M为GeneRuler TM DNA Ladder（华美产品），泳道1-7对应的样本基因型分别为aa/aa，-- SEA /αα，-α 3.7 /αα，-α 3.7 /-α 3.7 ，-α 4.2 /αα，-α 4.2 /-α 4.2 ，-α 3.7 /-α 4.2 。
M:The marker（GeneRuler TM DNA Ladder）.The genotyes of samples corresponding to from lane1to lane7were aa/aa，-- SEA /αα，-α 3.7 /αα，-α 3.7 /-α 3.7 ，-α 4.2 /αα，-α 4.2 /-α 4.2 ，-α 3.7 /-α 4.2 .
2.2 海南汉、黎族人群中α-地中海贫血（-- SEA 、-α 3.7 、-α 4.2 ）等位基因频率（见表1）。三种缺失在海南汉族人群中的频率分别为0.0127、0.0305和0.0203，在黎族人群中的频率分别为0.0075、0.1716和0.1891。两个人群中的三种缺失型α-地中海贫血突变经χ 2 检验均符合Hardy-Weinbery遗传平衡。
2.3 海南省汉、黎族人群中-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 缺失突变的基因型（见表2）。在197例海南汉族人中检出25例α-地中海贫血携带者，携带率为12.69%，共发现-- SEA /αα、-α 3.7 /αα和-α 4.2 /αα三种基因型，其中-- SEA /αα5例，-α 3.7 /αα12例，-α 4.2 /αα8例;在201例海南黎族人中检出114例α-地中海贫血携带者，携带率为56.72%，共发现- -SEA /αα、-α 3.7 /αα、-α 3.7 /-α 3.7 、-α 3.7 /-α 4.2 、-α 4.2 /αα和-α 4.2 /-α 4.2 六种基因型，其中-- SEA /αα3例，-α 3.7 /αα39例，-α 3.7 /-α 3.7 6例，-α 3.7 /-α 4.2 18例，-α 4.2 /αα38例，-α 4.2 /-α 4.2 10例。
表1 海南省汉、黎族人群中三种α-地中海贫血缺失突变的等位基因频率（略）
Tab1 The allelic frequencies of threeα-thalassemia deletion mutation（-- SEA 、-α 3.7 、-α 4.2 ）in Han and Li nationalities of Hainan provinc
表2 海南省汉、黎族人三种缺失型α-地中海贫血突变的基因型结果（略）
Tab2 The genotypes of threeα-thalassemia deletion（-- SEA 、-α 3.7 、-α 4.2 ）in Han and Li nationalities of Hainan Province
3 讨论
α-地中海贫血是一种遗传性溶血性血液疾病，也是世界上最常见的单基因遗传病之一，其主要特征是α-珠蛋白链合成减少（α + 地贫）或缺如（α 0 地贫）。我国南方各省是该病的高发地区。因此，研究我国南方各省分的α-地中海贫血的基因类型和频率分布，对开展遗传咨询和确定有效的普查法、产前诊断策略具有重要意义。
以聚合酶链反应（PCR）技术直接筛查海南省汉、黎族人群中三种我国最常见缺失型α-地中海贫血基因型，发现东南亚型缺失（-- SEA ）、右侧缺失（-α 3.7 ）和左侧缺失（-α 4.2 ）在197例海南汉族人中检出25例α-地中海贫血携带者，携带率为12.69%，而在201例海南黎族人中检出114例α-地中海贫血携带者，携带率为56.72%，三种α-地中海贫血缺失突变的基因频率为0.3607，其中左侧缺失（-α 4.2 ）和右侧缺失（-α 3.7 ）的基因频率分别高达0.1891和0.1716，明显高于汉族人群;在基因型分析中共检出六种基因型，以右侧缺失型杂合子（-α 3.7 /αα）、左侧缺失型杂合子（-α 4.2 /αα）、右侧缺失型并左侧缺失型双重杂合子（-α 3.7 /-α 4.2 ）为主，但某些基因型的构成比与汉族人群不同，-- SEA /αα基因型的比例较低，仅占2.63%，明显低于汉族人群。海南汉、黎族人群中三种我国最常见缺失型α-地中海贫血基因型已达到了Hardy-Weinbery遗传平衡，说明以上三种缺失型α-地中海贫血的基因突变类型在海南汉、黎族人群中是较早发生的事件。本次研究结果表明，海南省汉、黎族人群是α-地中海贫血的高发群体，且以右侧缺失（-α 3.7 ）和左侧缺失（-α 4.2 ）为主，另外海南汉族人群中α-地中海贫血突变的携带率（12.69%）与广西（14.95%）和广东（8.3%）地区接近，但远高于全国平均水平（2.64%）以及香港（4.5%）、台湾（4%）、江西（2.60%）、四川（1.92%）、浙江（1.20%）、新疆（0.47%）、上海（0.25%）的α-地中海贫血突变携带率 ［8～11］ ;而海南黎族人群中α-地中海贫血突变的携带率（56.94%）更是高居全国之首。海南黎族人群居住地为疟疾高发区，其人群中α-地中海贫血突变的携带率如此之高，可能与疟疾的优势选择作用有关。
过去曾用醋酸纤维素薄膜电泳法筛查海南省汉族人新生儿中的α-地中海贫血携带者，再应用聚合酶链反应（PCR）技术筛查α-地中海贫血Hb Bart's携带者中的东南亚缺失型突变，当时筛查结果表明，在海南省汉族人中α-地中海贫血突变的携带率为4.51%，其中东南亚缺失型突变的携带率为2.41%，占海南省汉族人群中α-地中海贫血总数的53.49% ［6］ 。以上筛查结果与本次研究结果比较，除了东南亚缺失型突变的携带率基本一致（2.41%与2.54%）外，α-地中海贫血突变的携带率结果（4.51%与12.69%）相差较大，其原因可能是用微量醋酸纤维素簿膜电泳法检测患者血样，以出现异常快速区带（Hb Bart's区带）者确定为α-地中海贫血突变携带者的初筛方法，导致了部分静止型α-地中海贫血的漏检，造成对海南省汉族人中α-地中海贫血突变携带率的检测结果严重偏低。静止型α-地中海贫血几乎无临床症状，血液学指标基本正常，用传统血液学分析法筛查恐有较多遗漏。因此，应用聚合酶链反应（PCR）技术筛查α-地中海贫血的三种常见突变是一种快速、准确的方法，可以减少静止型α-地中海贫血的漏检。
本研究获得了海南省汉、黎族人群中α-地中海贫血基因突变类型、基因频率和构成比的资料，为阐明海南省α-地中海贫血分子缺陷提供科学依据，对于海南省地中海贫血的防治具有重要意义。
参考文献:
［1］Higgs DR，Vickers MA，Wilkie AOM，et al.A reviewof the molecular ge-netics of the humanα-globin gene cluster［J］.Blood，1989，73:1081～1104.
［2］肖维威，徐相民，徐钤.中国人缺失型α地中海贫血的分子基础及产前基因诊断［J］.第一军医大学学报，1998，18:68～72.
［3］区采莹，蒙晶，陈力昌.海南籍汉族学生α-地中海贫血基因频率的分析［J］.海南医学院学报，2001，7（3）:137～139.
［4］区采莹，蒙晶，许蕴碧，等.海南343名黎族小学生α-地中海贫血基因型调查［J］.海南医学，1999，10（2）:112～113.
［5］Lahiri DK，Schuabel B.DNA isolation by arapid method from human blood samples:Effects of MgCl 2 ，EDTA，storage time，and temperature on DNA yield and quality［J］.Biochem Genet，1993，31（718）:321～328.
［6］周代锋，蔡望伟，韩建勋，等.海南汉族人群中东南亚缺失型α地中海贫血的研究［J］.海南医学院学报，2001，7（2）:70～72.
［7］Amold S.-C.Tan，Thuan C.Quah，Poh S.Low，et al.Arapid and reliable7-deletion multiplex polymerase chain reaction assay forα-thalassemia［J］.Blood，2001，98（1）:250～251.
［8］Zeng YT，Huang SZ.Disorders of haemoglobin in China［J］.JMed Genet，1987，24（10）:578～583.
［9］曾瑞萍，胡彬，金龙金.广东地区血红蛋白H病基因型分析及高危胎儿基因诊断［J］.中华医学遗传学杂志，1996，13（5）:266～268.
［10］ Li AM，Lee FT，Todd D.The screening of Chinese cord blood for haemoglobinopathies［J］.Hum Hered，1982，32（1）:62～70.
［11］ Lin TM，Eng HL，Kuo PL，et al.Neonatal screening for alpha-tha-lassemia in southern Taiwan［J］.J Formos Med Assoc，1992，91（12）:1213～1215.
