摘要:目的 寻找一种用于群体筛查地中海贫血基因的方法。 方法 用多重PCR技术，一次反应筛出β-地中海贫血携带者（β°CD41/42）及α 2 基因缺失的携带者。 结果 在1207例黎族群体中筛出β°CD41/42（-TCTT）地贫携带者123例（占10%）。筛出α 2 基因全缺失212例（其中HbH病3例）。 结论 本法适合于黎族人群地中海贫血基因的筛查。
关键词:地中海贫血;多重PCR;筛查
Investigation into the methods of screening thalassemia gene in LI Nationality population in Hainan.
ZHENG Shi-hua，OU Cai-ying，MENG Jing，et al.
（Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou570102，Hainan，P.R.China）
Abstract:Objective To find a method that can be used for massively screening of thalassemia gene Li Nationality community. Methods Multiplex-PCR was used for screeningβ-thalassemia carriersβ°CD41/42）and theα 2 gene deficient carriers in a sin-gle reaction. Results Out of the1207Li Nationality samples123thalassemia carriers（accounted for10%）and212completeα 2 gene deficient carriers（including3HbH disease patients）were detected. Conclusion The method is suitable for scredning tha-lassemia gene carriers in Li Nationality population.
Key words:Thalassemia;Multiplex-PCR;Screening
地中海贫血是我国南方常见的一种遗传性血液病，其共同特点是由于珠蛋白基因缺失或缺陷使血红蛋白中珠蛋白链合成受抑制，导致血红蛋白成分组成结构发生改变，临床上以慢性进行性溶血性贫血为主要表现，轻型可无或仅有轻度贫血，重者有严重贫血、肝脾肿大、生长发育落后及骨骼改变等，目前除干细胞移植外尚无其他有效的根治方法。重症患儿需输血以维持生命，大部分患儿因输血并发症或严重贫血死于成年之前，严重影响家庭和儿童生活质量。海南是地中海贫血高发区，尤其在黎族人群中β-地贫的发生率高达6%～8% ［1］，且95%以上为β°CD41/42（-TCTT）突变。α-地贫基因携带率55.1% ［2］ ，以缺失型多见，而无论α 3.7 或α 4.2 的缺失都与α 2 基因有关，根据这些特点，设计一种在群中以筛查β°CD41/42（-TCTT）及α 2 基因为目的多重PCR技术，为海南省黎族人群优生工作提供简易可行的实验方法。
1 材料与方法
1.1 样品来源 在海南6个县、市五个支系黎族人口选择并签署知情同意书的1207人（其中陵水县343例、白沙县265例、通什148例、保亭县343例、东方县149例、乐东县144例），各取外周血0.1ml，置于含EDTA10μl在抗凝管中混匀。
1.2 群体筛查 每例标本各取抗凝血10μl用于血红蛋白电泳和红细胞脆性试验（按本科室常用方法）。
1.3 DNA提取 取0.1ml抗凝血分离白细胞，按常规方法用chelex-100提取DNA样品 ［3］ 。
1.4 PCR扩增
1.4.1 引物设计 P 1 Gen Bank HumHBA 4 编号7369-7388 5 -GCTGACCTCCAAATACCGTT-3 P 2 Gen Bank HumHBA 4 编号7548-7525 5 -CCATTGTTGGCACATTCCGGGACA-3P 3 Gen Bank HumHBGL 3 编号387-413 5 -TCTACCCTTGGACCCAGAGGTTGA-3P 4 Gen Bank HumBGL 3 编号665-643 5 -TCCTATGACATGAACTTAACCAT-3P 5 Gen Bank HumBGL 3 编号1055-1074 5 -GTGTACACATATTGACCAAA-3 P 6 Gen Bank HumBGL 3 编号1477-1457 5 -AGCACACAGACCAGCACGTT-3
其中P 1 -P 2 为扩增α 2 基因引物对，扩增片段为180bp，P 3 -P 4 为扩增β°CD41/42（-TCTT）引物对，扩增片段为275bp，P 5 -P 6 为扩增正常β-链基因引物对，作为本试验的内对照物，扩增片段长度423bp。
1.4.2 试剂配制 P 1 -P 2 各3.0μl、P 3 -P 4 各3.0μl、P 5 -P 6 各4.0μl;10mM dNTP10μl;10×Buffer（MBI）50μl;25mMMgCl 2 50μl;双蒸水300μl;配成反应混合液，每管分装20μl。
1.4.3 反应条件 取试剂20μl，样品3μl，加入MBIE1.0U/μl配剂反应混合液94℃预热5min，然后94℃30s，55℃40s，72℃45s，32个循环后，72℃5min延伸。
2 结果
经2%琼脂糖凝胶电泳后，结果显示正常者只出现两条区带一为α 2 基因的180bp区带;一为作为实验正常对照的β基因的423bp大小的区带。若180bp带缺失为α-地 2 纯合子;出现275bp为β°CD41/42的杂合子。见图1。
图1 地中海贫血α 2 全缺和β°CD41/42复合体PCR扩增电泳图（略）
1:α 2 全缺;2、4:正常;3:β41/42杂合子;5、6:α 2 全缺及β41/42复合体
在1207例样品中检出β°CD41/42（-TCTT）携带者123例，占10%;检出α 2 基因全缺212例，占17.6%（其中HbH病例3例），至于是否左侧或右侧缺失再作进一步分析（另文讨论）。
3 讨论
地中海贫血在东南亚及我国南方发病率非常高，由于不同程度的α珠蛋白基因缺失使其表型各异，临床表现不同，单个或二个α基因的缺失在临床上症状轻微甚至无任何临床症状及血象改变，故易被漏诊。由于中国人中常见的缺失型地贫--α 3.7 、--α 4.2 和-- sea 均与α 2 基因有关 ［2］ ，因此对α 2 基因进行筛查，可检出缺失型HbH、及左侧或右侧缺失型的α-地 2 基因的携带者，本方法虽能检出α-地 2 基因的纯合子，结合电泳图谱可检出缺失型HbH患者，但如进一步确诊尚须鉴定左侧抑或右侧缺失;且本方法虽然未能检出约5%除基因型为β°CD41/42以外的β-地贫，但可借助Hb电泳、红细胞脆性试验及HbA 2 定量，对疑似β-地贫患者进一步做斑点杂交法进行确诊。本筛查法简便、可靠、经济易行，用时可采用快速法提取DNA，可在3～4h内得到结果。因此本法适用于β°CD41/42及α-地 2 高发区人群基因筛查;对于重型地贫的预防，提高人口素质有重要的意义。
参考文献:
［1］陈洛夫，黄冬爱，文平中，等.95例黎族人地中海贫血基因类型分析［J］.海南大学学报自然科学版，1993，11（2）:47～49.
［2］区采莹，蒙晶，陈历昌.海南籍汉族学生地中海贫血基因频率的分析［J］.海南医学院学报，2001，7（3）:137～139.
［3］区采莹，蒙晶，王传文，等.海南343各黎族小学生地中海贫血基因型调查［J］.海南医学，1999，10（2）:112.
［4］Chen LC，Chen LF，Huang SZ.et al.Screening and characterizatian ofβ-thalassemia in Li nationality on Hainan island［C］.The international con-ference on molecular biology of genetic disease.Shaihai，1992，11:4.
