【摘要】 目的 探讨反转录聚合酶链反应（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的应用。方法 40例行根治性手术的Dukes A、B期大肠癌患者，应用RT-PCR法检测切除的492个淋巴结中细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）20 mRNA的表达；另取2例Dukes C期大肠癌的8个HE染色阳性淋巴结作为阳性对照，2例良性胃肠道疾病的15个淋巴结作为阴性对照；并采用系列稀释试验检测本法的敏感性。 结果 40例Dukes A、B期大肠癌患者的492个淋巴结中有17例的53个检测到CK20 mRNA的表达；2例Dukes C期大肠癌的8个HE染色阳性淋巴结RT-PCR结果均为阳性，2例良性胃肠道疾病的15个淋巴结RT-PCR结果均为阴性。系列稀释试验提示CK20 RT-PCR的敏感性为105个正常淋巴细胞中检测到1个肿瘤细胞存在。结论 CK20 RT-PCR是检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移灵敏而又特异的方法。
【关键词】 大肠肿瘤；淋巴转移；微转移；基因诊断；反转录聚合酶链反应；角蛋白20
【Abstract】 Objective This study was undertaken to investigate the clinical implication of reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect lymph nodes micrometastases in Dukes A and B colorectal cancer patients.Methods We examined 492 lymph nodes obtained from 40 colorectal cancer patients of Dukes A and B who underwent curative operation，using RT-PCR to detect the expression of cytokeratin 20(CK20) mRNA. Eight lymph nodes proved pathologic positive were served as positive control and 15 lymph nodes obtained from 2 patients with benign disease as negative control. We also used serial dilution experiment to determine the sensitivity of this method.Results Among 492 lymph nodes，CK20 mRNA expression was detected in 53 of 17 cases. CK20 mRNA expression was detected in all positive control and undetected in all negative control. The results of serial dilution experiment indicated that the limit of sensitivity was 1 tumor cell per 105 normal lymphocytes.Conclusion CK20 RT-PCR is a sensitive and specific method to detect lymph node micrometastases in colorectal cancer patients of Dukes A and B.
【Key words】 colorectal neoplasms；lymphatic metastases；micrometastase；genetic diagnosis；reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)；keratin 20
大肠癌术后转移和复发是患者的主要死亡原因。行根治术的患者约有20%～40%在5年内出现转移或复发［1］，但这些患者在手术前后的常规检查中（包括手术探查、B超、CT等）并未发现显性转移，而微小的转移灶是客观存在的。我们将这些微小的存在于血循环、淋巴道、骨髓和其它各组织脏器中临床常规检查难以发现的转移灶称为微转移。微转移虽小，但有发展形成致命显性转移灶的可能，因此明确微转移的存在与否对确定最佳治疗方案和判断预后具有积极的意义。
淋巴结转移与否是判断大肠癌预后和指导术后化疗的重要指标，常规的病理组织学检查在敏感性等许多方面存在不足。因此，寻找一种敏感而特异的方法检测淋巴结中肿瘤转移尤其是微转移的存在具有重要的临床意义。本实验采用反转录-聚合酶链反应（Reverse-Transcriptase PCR，RT-PCR法）反转录并扩增Cytokeratin(CK)20基因的mRNA，以检测大肠癌淋巴结微转移的存在。
1 材料与方法
1.1 材料 我院1999年1月～12月行根治性手术的Dukes A、B期大肠癌患者40例。男23例，女17例；年龄32～80岁（62.31±14.19岁）。结肠癌24例，直肠癌16例；Dukes A期6例，Dukes B期34例；肿瘤超过肠腔周径1/2的14例，未超过26例；膨胀型生长17例，浸润型生长23例；分化好8例，中21例，分化差11例。手术切除的标本立即分离淋巴结并取一小块肿瘤组织，每个淋巴结均一切为二，一半做常规病理切片HE染色，另一半液氮冻存直至RNA抽提，淋巴结总数492个，平均14.3个/例。此外，取2例良性胃肠道病变的15个淋巴结（1例胃溃疡患者10个，1例直肠腺瘤患者5个）作为阴性对照；取2例Dukes C期大肠癌患者的8个HE染色阳性淋巴结作为阳性对照。
1.2 RT-PCR法 本实验采用RT-PCR法定性检测CK20 mRNA，同时选择管家基因磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参照证明抽提RNA的完整性。
1.2.1 RNA抽提 采用Trizol试剂（华舜产品）一步法抽提组织总RNA（具体步骤详见操作手册），取部分RNA样品稀释后测OD值，OD260/OD280在1.8～2.0之间，并换算浓度。
1.2.2 引物设计与合成 CK20基因全长18061bp，共有8个外显子和7个内含子，本实验所用的上游引物和下游引物分别位于第1和第3外显子，RT-PCR合成的片段包含第1外显子的后半段、第2外显子的全部和第3外显子的前半段。引物由Beckman Oligo 1000M DNA合成仪合成，序列如下：
CK20 Sense Primer：5’-CAG ACA CAC GGT GAA CTA TGG-3’
Antisense Primer：5’-GAT CAG CTT CCA CTG TTA GAC G-3’
GAPDH Sense Primer：5’-ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG- 3’
Antisense Primer：5’-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-5
1.2.3 反转录合成cDNA和PCR反应 本实验采用Access RT-PCR试剂盒（Promega），反转录和PCR在同一试管、单一缓冲液中完成。每个RNA样品分别用CK20和GAPDH引物进行RT-PCR反应，步骤如下：在0.5ml离心管中依次加入无RNA酶的水，5×缓冲液5μl（终浓度为1×），dNTP 0.5μl（终浓度0.2mM），CK20或GAPDH的上游和下游引物各0.5μl（终浓度1μM），25mM MgSO4 1μl（终浓度1mM），AMV反转录酶、Tfl DNA合成酶各0.5μl（终浓度0.1U/μl）和1μg总RNA，整个反应体系25μl，加样过程在冰上进行。加样完成后，轻微振荡混匀，放入PTC-100TM热循环仪（MJ Research）。首先48℃ 45min进行反转录（cDNA第一链合成），然后94℃ 2min使AMV酶失活并使RNA/cDNA/引物变性，以后按以下条件合成cDNA第二链和进行PCR扩增。CK20引物存在时反应条件为94℃ 1min、62℃ 2min、68℃ 2min共40次循环；GAPDH引物存在时为94℃ 1min、63℃ 1min、68℃ 2min共30次循环，最后68℃ 7min。CK20和GAPDH扩增的终产物长度分别为370bp和626bp。同时用不加RNA的反应体系进行PCR扩增作为空白对照；不加AMV反转录酶进行PCR扩增排除基因组DNA的污染。
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 取10μl RT-PCR产物在含05μl/ml溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳后的凝胶由Floruo-S Multi Image全自动图象分析仪（BIO RAD）扫描并打印成像。
1.2.5 测序 RT-PCR产物应用ABI PTISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmpliTaq DNA Polymerase，FS (Perkin Elmer)，经ABI PTISMTM 377XL DNA测序仪检测序列。
1.3 敏感性检测 系列稀释试验。
1.3.1 肿瘤单细胞悬液的制备 肿瘤细胞来自一69岁女性盲肠癌患者，术后病理为高分化腺癌。手术标本取下后立即用生理盐水冲洗干净，剪除脂肪等非肿瘤组织，无菌情况下剪成1mm3的碎块；加入终浓度为0.1%胶原酶、001%透明质酸酶和0.02%DNA酶，4℃消化过夜；消化后的悬液用100目尼龙网过滤去除未被消化的组织碎块；按2：1的比例加入75%的淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），室温1800rpm离心20min，吸取中间云雾状的肿瘤细胞悬液；PBS漂洗2次；用含10%小牛血清的RPIM 1640（Promega）培养液调整细胞数至5×105/ml。
1.3.2 淋巴细胞分离 抽取一健康成人10ml外周静脉全血并肝素化，Hanks液2倍稀释后按2：1的比例加入淋巴细胞分离液，室温2000rpm离心20min，吸取中间云雾状的淋巴细胞悬液，PBS漂洗2次，计数约107。
1.3.3 系列稀释和RT-PCR 将肿瘤细胞按10倍递减稀释成含细胞数105～100的混悬液，分别混入106个淋巴细胞中，抽提细胞总RNA，以后步骤和RT-PCR方法同1.2。
2 结果
2.1 肿瘤、对照样本 所有40例大肠癌患者的肿瘤组织和2例良性胃肠道疾病的病变组织（胃溃疡和直肠腺瘤组织）RT-PCR产物经电泳均可见370bp的条带（图1），即表示有CK20 mRNA的表达；2例良性胃肠道病变的15个淋巴结RT-PCR结果均为阴性，而2例大肠癌患者的8个HE染色阳性淋巴结RT-PCR结果均为阳性（图2）。以上标本行GAPDH的RT-PCR产物均可见626bp的条带，证实RNA完整无降解。 
图1 大肠癌和良性胃肠道疾病病变组织中CK20 mRNA的表达
M，分子量参照物(100bp DNA ladder)；1，胃溃疡组织；2，直肠腺瘤组织；3～7，4例大肠癌患者的肿瘤组织；B，不加RNA模板的空白对照：C，不加AMV酶的阴性对照。 
图2 RT-PCR扩增良性胃肠道疾病淋巴结的电泳结果
M，分子量参照物；B，空白对照：Ad，直肠腺瘤组织； 1～3，直肠腺瘤患者的3个肠旁淋巴结；4～6，胃溃疡患者的4个胃小弯淋巴结。
不加RNA的反应体系作为空白对照进行PCR扩增结果为阴性；不加AMV反转录酶的反应体系进行PCR扩增结果为阴性，证实无基因组DNA的污染。
将存在CK20引物的RT-PCR产物进行测序，结果与Gene Bank检索所获得的序列一致，提示RT-PCR结果正确。
2.2 Dukes A、B期大肠癌患者的淋巴结样本 40例Dukes A、B期大肠癌的492个淋巴结，有17例（Dukes A期4例，Dukes B期13例）的53个淋巴结RT-PCR结果为阳性（图3），个数阳性率10.77 %，例数阳性率42.50%。以上所有标本GAPDH的RT-PCR均阳性，证实RNA完整无降解。 |
