作者：张小燕 梁朝 赵林 张威 李芊 崔伟光

 【摘要】  目的  改进静脉内皮细胞原代培养的方法，提高体外培养血管内皮细胞的成功率。方法  采用5号带柄一次性静脉输液针灌注消化液，分别用0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化脐静脉内膜，比较三种酶液消化的结果，并在倒置相差显微镜下观察其形态特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。结果  0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶的最佳消化时间分别为15min，10min，12min。倒置相差显微镜下观察内皮细胞为单层生长，鹅卵石样镶嵌排列。免疫组织化学检测表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原。结论  胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，且0.1%胶原酶消化12min获得的细胞数量多，成活率高。
   
    【关键词】  人脐静脉  内皮细胞  细胞培养  分离  改进
   
    Improvement of separation ，culture and identification of human 
    
      
    【Abstract】  Objective  To investigate  the primary culture method of ehdothelial cells from human umbilical vein and improve the rate of successful culture in vitro.Methods  0.125%，0.25% trpsin and 0.1% collagenase were injected into the human umbilical vein by using disposable vein transfusion needle No.5，after which the endothelial cells were identified by morphology and immunohistochemistry under inverted microscope.Results  The cultured cells had a cobble stone appearance with a strict monolayer growth and had Ⅷ related antigen. There are many endothelial cells after digested by 0.125%，0.25% trpsin and 0.1% collagenase for 15 minutes，10 minutes，12 minutes respectively.Conclusion  The collagenase was the best choice to isolate ehdothelial cells from human umbilical vein.
   
    【Key words】  human umbilical vein  endothelial cells  cell culture  separation  improvement
   
    血管内皮细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管舒缩，抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细胞功能及其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。本文报告利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带，采用改进的灌流消化法［1］分离脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）成功传代培养并予鉴定，方法可靠，简便易行，有利于后续实验研究的进行。
   
    1  材料与方法
    
    1.1  标本采集  在无菌条件下取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带（长于20cm）后，去除脐带血管中的残余血液，放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液PBS中，6h内行脐静脉内皮细胞分离、培养。
    
    1.2 试剂  RPMI1640培养基（美国GIBCO公司），新生小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅰ型胶原酶（美国GIBCO公司），胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
    
    1.3  仪器  Ⅱ级生物安全柜（苏净集团安泰公司），CO2培养箱(日本SANYO)，倒置荧光显微镜(重庆光学仪器厂)。
    
    1.4  试剂配制  RPMI1640完全培养液：20%新生小牛血清，80%RPMI1640，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。Ⅰ型胶原酶溶液：用不含Ca2+、Mg2+的Hanks液配制，0.22μm滤膜滤过除菌，保存于-20℃。
    
    1.5 人脐静脉内皮细胞原代培养  无菌条件下取新生儿脐带，在Ⅱ级生物安全柜内剪去钳痕、血肿、凝血块阻塞部分，分成20cm一段，采用5号带柄一次性静脉输液针吸取36℃预热双抗PBS，插入脐静脉断端，同时结扎固定针体，反复将静脉内残血冲洗干净，再用血管钳夹闭脐带另一端，然后分别注入所配制0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化液，使管腔充盈，37℃，作用6、8、10、12、15、17min；松开一端血管钳，收集脐静脉内的消化液，然后注入含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液再次冲洗管腔，以获得更多的内皮细胞；将消化液和冲洗液一并注入离心管，800r/min，离心5min，弃上清，加入RPMI 1640培养液，吹打均匀，制成细胞悬液，按2×105个细胞/瓶接种于25cm2一次性培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。24h后更换培养液去除未贴壁细胞，然后每隔24h半定量换液一次至细胞生长融合。
    
     1.6  人脐静脉内皮细胞传代培养  待细胞生长成单层细胞后，弃去培养瓶中的培养液，然后加入0.125%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液约2ml，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，用Hanks液洗一次，再加入RPMI 1640培养液终止消化，用吸管轻轻吹打混匀，按1：2比例接种传代。
    
     1.7  人脐静脉内皮细胞生长率的测定  具体方法参照“细胞培养”［2］，选择第一代脐静脉内皮细胞，按每孔2×104个细胞接种于24孔培养板内，37℃、5%CO2培养箱中培养，共培养8d。每天取3孔细胞，倒置显微镜下计数，取平均值，绘制生长曲线。
    
     1.8 人脐静脉内皮细胞鉴定
    
    1.8.1 形态学  利用倒置相差显微镜观察活体细胞的形态特点。
    
    1.8.2  Ⅷ因子相关抗原检测  在24孔培养板内放置无菌盖玻片1cm×1cm，将内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待内皮细胞长至汇合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗盖玻片，放入100%丙酮中固定15min，用PBS冲洗3次，每次2min，滴加3%的H2O2室温孵育8min，PBS冲洗3次，每次2min，滴加兔抗人Ⅷ因子相关抗原多抗工作液，放入湿盒内，4℃过夜，同时另一盖玻片上不加一抗作阴性对照。次日，用PBS冲洗3次，每次2min，滴加辣根酶标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，用PBS冲洗3次，每次2min，用DAB底物混合工作液显色，显微镜下观察，待出现特异性染色后，终止显色，进行复染，脱水，透明，封片。
   
    2  结果
    
    2.1 培养细胞的形态学观察  倒置相差显微镜下观察，人脐静脉内皮细胞为单层生长，呈短梭状或鹅卵石样镶嵌排列。原代培养时，接种于一次性培养瓶后3h开始贴壁。最初细胞呈圆形，单个或聚集成团，后逐渐伸展呈长梭形，胞浆丰富，胞核清晰可见，为圆形或椭圆形，细胞间可见相互连接。5d后，细胞基本汇合。传代细胞较原代细胞生长旺盛，有时可见多核细胞，传至第8代时，细胞变形，呈纤维化，不能形成单层生长。
    
   2.2  Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定  Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测，显微镜下观察细胞浆内可见棕色颗粒，核周密集，而对照细胞内未见着色。