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| 作者：杜艳 戴建国 吴平平 黄培林 【摘要】 目的 探讨黑色素瘤抗原(MAGEA3)、人类斯钙素(hSTC1)、上皮细胞角质蛋白(CK20、CK19)及癌胚抗原(CEA)等肿瘤标志物在食管癌患者外周血中的表达与肿瘤转移的关系。方法 采用RT-PCR方法检测MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA mRNA在55例食管癌患者术前外周静脉血中的表达，并分析表达结果与临床指标之间的关系。结果 55例食管癌患者外周静脉血中MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19和CEA mRNA的阳性率分别为25.45%、47.27%、49.09%、34.55%和52.73%，同时检测这5种靶基因，如果至少表达其中一种即可记为阳性表达者，其阳性率提高为72.73%。除CK19之外，MAGEA、hSTC1、CK20、CEA mRNA表达与肿瘤转移均有相关性(P＜0.05)。结论 RT-联合检测MAGEA3、hSTC1、CK20和CEA可以增加外周血循环癌细胞检测的敏感性，为了解肿瘤的恶性生物学行为(侵袭和转移)提供依据，从而为指导临床治疗方案的选择，判断预后及监测疗效提供帮助。
【关键词】 食管癌 黑色素瘤抗原A3 人类斯钙素1 上皮细胞角质蛋白 癌胚抗原
Clinical significance of detection of MAGEA3，hSTC1，CK20，CK19 and CEA
mRNA in the peripheral blood from patients with esophageal carcinoma
Du Yan，Dai Jianguo，Wu Pingping，et al.
Department of Pathology and Pathophysiology，School of Basic Medical Science，
Southeast University，Nanjing 210009.
【Abstract】 Objective To study the relationship between the expression of MAGEA3，hSTC1，CK20，CK19，CEA mRNA in the peripheral blood from patients with esophageal carcinoma and metastasis.Methods RT-PCR was used to detect MAGEA3，hSTC1，CK20，CK19，CEA mRNA in the peripheral blood from 55 patients with esophageal carcinoma，10 healthy volunteers，27 non-cancer.And to detect these five gene mRNA in 10 samples of esophageal carcinoma tissues served as positive control.Results All samples showed detectable of β-actin mRNA(housekeeping gene) and all tumor tissues showed the five target gene mRNA.MAGEA3，hSTC1，CK20，CK19 and CEA mRNA were detected in 25.45%，47.27%，49.09%，34.55%，52.73% blood of cancer，respectively，while CEA mRNA were detected in 3 blood of healthy donors and CK20，CK19，CEA mRNA were detected in 3 blood of non-cancer，respectively.When all five target genes were examined，the positive rate of expression of one gene was 72.73%.Lymph node metastasis and distant metastasis were associated with the presence of these four gene mRNA except for CK19.Conclusion It indicates that the combined detection of MAGEA3，hSTC1，CK20，CK19 and CEA mRNA in the blood of esophageal carcinoma is associated with poor prognosis tumor characteristics such as lymph node metastasis and tumor distant metastasis，and may be helpful for selecting treatment，estimating clinical prognosis and surveilling curative effect.
【Key words】 esophageal carcinoma MAGEA3 hSTC1 CK19 CK20 CEA peripheral blood
非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，具有转移潜能的肿瘤细胞在术前或术时已脱离原发灶，以非常少的数量播散并存活于淋巴结、骨髓、血液或远处器官中，常无任何临床表现，普通检测手段亦不能发现，称为肿瘤微转移(micrometastasis)。肿瘤细胞在外周血中的微转移是肿瘤复发和转移的重要起始步骤。早期发现肿瘤微转移将为指导临床治疗、监测疗效、判断肿瘤预后提供重要参考资料。目前临床上一般使用的肿瘤标志物敏感性较低，理论上和实践上都提倡对肿瘤标志物进行联合检测，以提高敏感性。而RT-PCR方法检测肿瘤特异性mRNA的表达已被证明是检查外周血、骨髓、淋巴结中循环细胞的敏感方法，本文对东南大学附属中大医院2003年7月到2004年9月住院的55例食管癌患者，拟用RT-PCR方法检测外周血中黑色素瘤抗原(Homo sapiens melanoma antigen，family A，3，MAGEA3)、人类斯钙素(Homo sapiens stanniocalcin 1，hSTC1)、上皮细胞角质蛋白20(Homo sapiens keration 20，CK20)、上皮细胞角质蛋白19(Homo sapiens keration 19，CK19)和癌胚抗原(Human carcinoembryonic antigen，CEA)基因的表达，并结合临床病理资料综合分析、探讨其与肿瘤转移的关系。
1 材料与方法
1.1 标本采集 55例食管癌患者均经病理科确诊，其中男39例，女16例，年龄36～83岁，平均年龄64.3岁。取术前外周静脉血3ml，另取27例非肿瘤病人(反流性食管炎14例、腐蚀性食管灼伤2例、贲门失弛缓症9例、食管憩室2例)和10例正常健康捐献者的外周血3ml，作为阴性对照。均于2h之内用Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，-70℃冻存。以10例食管癌患者手术中取得的新鲜肿瘤组织标本作为阳性对照。
1.2 试剂 Ficoll和Trizol试剂均为南京生兴生物技术有限公司产品；一步法RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 RNA的提取 Trizol一步法进行细胞和组织总RNA的抽提。
1.3.2 引物设计及合成 自行设计MAGEA3、hSTC1、CK20、CK19、CEA和内参照β-actin这6种基因mRNA引物，并合成，序列见表1。
表1 引物序列和扩增片段长度
1.3.3 一步法RT-PCR扩增 PCR反应体积为50μl，Mg离子浓度为5mmol/L，dNTP浓度为1mmol/L，引物浓度为0.4μmol/L，加上5U的AMV逆转录酶和5U的DNA Taq酶，于PTC-200型PCR仪内扩增，条件为50℃延伸15min，94℃ 2min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环，最后一个循环结束后，72℃延伸5min。
1.3.4 RT-PCR产物鉴定 加样于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，紫外光凝胶成像系统扫描。且产物经过纯化后进行DNA序列测定。
1.4 临床资料收集 收集全部患者的性别、年龄、肿瘤大小、细胞分化程度、组织病理学类型、浸润深度、临床病理分期、淋巴结转移及远处转移情况。本实验将患者按照这些临床资料进行分类列表探讨基因表达规律。根据年龄分为≤60岁、＞60岁两组；肿瘤大小按＜5cm、≥5cm分类；按病理形态将肿瘤分化程度分为高(分化良好)、中(分化中等)+低(低、未分化)两大类；浸润深度按TNM分期法分为T1～T2和T3～T4两栏进行比较。临床病理分期根据1987年国际抗癌联盟UICC制定的国际TNM标准，按0～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ两栏讨论。
1.5 统计学分析 用STATA软件分析各组数据，采用χ2检验及Fisher确切概率法，以P＜0.05为显著性差异。
2 结果
2.1 RT-PCR产物验证 扩增产物进行DNA序列测定，结果证实所得的产物的确为所要扩增的目的基因。 |
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