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【摘要】 目的 观察厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏基质金属蛋白酶-2和组织金属蛋白酶抑制因子-2表达的影响。方法 SPF级成年雄性SD大鼠随机分为正常对照（N）组（n=8）、糖尿病肾病（DN）组（n=9）和厄贝沙坦（Irb）治疗组（DNI）组（n=10）。 8周后RT-PCR法观察其在肾组织的表达。结果 二者在N组大鼠有微弱表达，DN组的表达较N组明显增加，DNI组二者的表达较DN组减弱。二者的比值在DN组减少，DNI组升高。结论 早期使用Irb能够调节二者平衡，减少细胞外基质（ECM）聚积，从而发挥肾脏保护作用。
【关键词】 厄贝沙坦 基质金属蛋白酶-2 组织金属蛋白酶抑制因子-2 糖尿病肾病
Effects of irbesartan on expression of matrix metalloproteinase-2/tissue
【Abstract】 Objective To observe the effects of irbesartan on expression of matrix metalloproteinase-2/tissue inhibitor of metalloproteinase -2 in streptozotocin induced diabetic rats. Methods Male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups： normal control rats (group N，n=8)， diabetic rats (group DN，n=9) and diabetic rats treated with Irb (group DNI，n=10). Diabetes was induced by injection of STZ intraperitoneally after rats had received uninephroectomy. Renal expression of MMP-2 and TIMP-2 was determined by RT-PCR when all rats were sacrificed at week 8.Results Semi-quantitative assessment of RT-PCR showed that glomerular expression of MMP-2 and TIMP-2 in group DN was significantly increased as compared to that in group N and much lower in group DNI compared to that in group DN.While the ratio of MMP-2/ TIMP-2 was lower in group DN and higher in group DNI.Conclusion The changes of the expression of MMP-2 and TIMP-2 might play a pathogenetic role in diabetic nephropathy. Irb exerted renal protective role to early diabetic nephropathy， possibly through correction the balance of MMP-2/ TIMP-2 which benefited to reduce accumulation of extracelluar matrix(ECM).
【Key words】 irbesartan matrix metalloproteinase-2 tissue inhibitor of metalloproteinase-2 diabetic nephropathy
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要并发症和死亡原因之一，为提高糖尿病患者的生活质量及生存率，使得早期防治糖尿病肾病尤为重要。本研究用RT-PCR方法了解基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和组织金属蛋白酶抑制因子-2（Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 ，TIMP-2）在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠肾组织中的表达情况，并探讨新一代的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensinII receptor antagonist，AIIRA）厄贝沙坦(irbesartan，Irb)对糖尿病大鼠尿白蛋白排泄、早期肾肥大的改变以及肾脏MMP-2和TIMP-2表达的影响，以阐明其肾保护作用机制，为DN的预防和治疗提供实验理论依据。
1 材料与方法
1.1 糖尿病模型建立和分组 选择SPF级成年雄性SD大鼠，购自中国科学院上海实验动物中心［许可证号：SCXK(沪)2002-0010］，体重(180±20)g。大鼠右肾切除2周后一次性腹腔注射STZ(Sigma公司， 50mg/kg)诱导糖尿病模型。48h后测血糖，以随机血糖＞16.7mmol/L且尿糖强阳性作为糖尿病动物模型建立标准，未达到标准者均淘汰。血糖稳定1周后随机分为糖尿病肾病（DN）组（n=9）和厄贝沙坦治疗组（DNI， Irb 50mg/kg灌胃）（n=10）。另设8只大鼠为正常对照（N）组（n=8），给予等量枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。N组及DN组仅予等量自来水灌胃。实验期间血糖保持在20mmol/L左右。
1.2 一般观察指标和测定方法
1.2.1 生化指标 外周血血糖用微量血糖仪检测；血生化指标及尿肌酐用自动生化分析仪检测；CCr按公式：尿肌酐浓度（mg/ml）×每分尿量（ml）/血肌酐浓度（mg/ml）计算，并用体重校正。
1.2.2 尿白蛋白测定 采用液相免疫沉淀方法。
1.3 病理组织切片染色 采用H.E染色。
1.4 RT-PCR (1)肾组织总RNA的提取；(2)测定RNA浓度、纯度和完整性；(3)引物：MMP-2：5′ GGTTTATTTGGCGGAC 3′；5′ TCAGCAGCCCAGCCAGTC 3′［1］512bp；TIMP-2：5′GGCAAGATGCACATTACC 3′；5′TTGACATCCCTTCCTGGA 3′［2］386bp；β-actin：5′ GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA 3′；5′ GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT 3′［3］632bp；(4)在PCR仪中42℃ 60min，99℃ 5min进行逆转录；(5)扩增：95℃ 7min×1 cycle；95℃ 55sec Tm 56sec 72℃ 1min×36 cycles；72℃ 10min×1 cycle；6 以1.7%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，电压100mV，约40min用Image Master VDS扫描分析仪扫描凝胶图谱。用Total Lab分析软件对PCR条带进行密度扫描分析，目的片段和β-actin的比值作为实验数据。
1.5 统计学方法 所有数据均以x±s表示，采用Prism 3.0统计软件，组间比较采用方差分析或t检验和U检验。P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 各组大鼠血糖、体重变化 由表1可知，腹腔注射STZ后，糖尿病大鼠血糖明显上升，体重明显减轻。但是DN组与DNI组大鼠血糖无差异（P＞0.05）。
2.2 各组大鼠CCr、24hUalb的改变 由表2可见，8周时DN组CCr较N组明显升高（P＜0.01），而DNI组CCr较DN组明显下降（P＜0.01），但未恢复至正常水平。DN组大鼠24hUalb 8周时与N组相比明显升高（P＜0.01），DNI组与DN组同期相比，24hUalb明显减少（P＜0.01），但与N组相比仍增高(P＜0.01)。
2.3 各组大鼠肾脏肥大指标的改变 如表1所示，8周时DN组肾重、肾脏肥大指数（肾重/体重×1000）较N组明显增加（P＜0.01），DNI组肾重、肾脏肥大指数（肾重/体重×1000）较DN组显著减少(P＜0.05或P＜0.01)，提示肾脏肥大明显受抑制，但与N组比较仍差异有非常显著性(P＜0.01)。
2.4 肾组织病理学改变和定量分析 8周后，正常大鼠肾小球和肾小管间质未见明显的病理改变。糖尿病大鼠肾组织可见肾小球体积明显增大，系膜区增宽，但未见明显的肾小球硬化。病理定量分析结果表明（表1），至8周时DN组肾小球面积和体积较N组明显增加（均为P＜0.01），DNI组与DN组比较明显减小（均为P＜0.01）。
2.5 肾组织MMP-2和TIMP-2的表达及半定量结果比较 MMP-2和TIMP-2在N组大鼠有微弱表达，DN组大鼠二者的表达较N组明显增加（均为P＜0.01），经Irb治疗后的DNI组二者的表达较DN组明显减弱（均为P＜0.05）（图1）。但MMP-2/TIMP-2的比值在DN组减少，DNI组升高（均为P＜0.05）（见表3）。
图1 8周各组大鼠MMP-2/TIMP-2 RT-PCR结果：N组大鼠有微弱表达，DN组大鼠二者的表达较N组明显增加，经Irb治疗后的DNI组二者的表达较DN组明显减弱。N：正常组；DN：糖尿病组；DNI：Irb治疗组
表1 8周后各组大鼠血糖、体重及肾脏肥大的比较 （x±s）
注：**P＜0.01与正常组比较；##P＜0.01，#P＜0.05与糖尿病组比较。N：正常组；DN：糖尿病组；DNI：Irb治疗组 |
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