作者：李斌元，马云，何淑雅，钟 南，孙春莉，闵凌峰

【摘要】  目的  检测脆性X染色体综合征智力低下基因FMR1中（CGG）n拷贝数的多态性。方法  采用PCR结合序列胶银染法、Southern blot杂交分析法，对299条表型正常的湖南省人群X染色体FRAXA位点（CGG）n拷贝数的多态性及分布频率进行了测定和验证。结果  显示其范围为20～40，高峰为28 ，PCR-序列分析银染法结果与Southern blot法结果完全一致。结论  检测了湖南省人群X染色体FRAXA位点（CGG）n拷贝数的多态性；运用PCR-序列分析胶银染法快速、直接、简便、实用，适合脆性X综合征的大规模群体筛查。

    【关键词】  脆性X综合征  FMR1  （CGG）n  PCR

    The study of the unsteady DNA repeat located  in the mentally  retardant FMR1 gene  of fragile X  

   【Abstract】  Objective  To detect the polymorphism of CGG repeats located  in the mentally  retardant FMR1 gene  of fragile X.Methods  To detect and test the polymorphism and frequency of CGG repeats located in the FRAXA region come from 299 chromosome of normal hunan pupulations.Results  The normal range of CGG repeats is 20-40，the mean number is 28， the data showed that the results of PCR-sequence gel silver staining was the same as those of PCR-Southern blot. Conclusion  Realize the polymorphism of CGG repeats located  in the FRAXA locus;2. The PCR-Sequence gel silver staining was more rapid，immediate， simple and economy ，which suits to the colony screening fragile X syndrome on a large scale.

    【Key words】  fragile X syndrome  FMR1  CGG repeats  PCR

    脆性X综合征（fragile X syndrome，FraX）是常见的遗传性智力低下性疾病之一，其发病率仅次于唐氏综合征。在人群中男性的发病率约为1/4000［1］，女性的发病率为1/2500［2］。其在细胞学上主要表现为Xq27.3带处有一细丝样的脆性位点（FRAXA）［3］，在分子水平上表现为FMR1基因5’端（CGG）n的异常扩增。（CGG）n在正常人群体中呈多态性，n=6-50，当n=50-200时为前突变，n＞200时为全突变，同时伴随其周围CpG岛异常甲基化［4］。我们根据FraX基因致病特点，通过测定湖南省人群中CGG重复序列，了解其分布的多态性，并建立一个简便、快捷的基因检测方法。

    1  材料和方法

    1.1  研究对象及标本  208名人群为本校附属医院门诊自愿受检者，男117名，女91名，年龄24～56岁，平均36.5岁。分别从肘静脉抽取血1～2ml，以草酸钾抗凝，标本按碘化钾法提取DNA。

    1.2  主要试剂  T4多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均为NEB公司产品，杂交液、尼龙膜、PCR扩增相关试剂均购自上海生工，探针PE5.1由美国纽约州立发育不全基础研究所Nanbert Zhong博士惠赠。

    1.3  PCR扩增  PCR引物设计参照文献［5］，在FMR1基因内（CGG）n重复区域两侧合成引物。其中上游引物为：5’-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3’，下游引物为：5’-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG -3’。反应体积为20μl，其中包括10×PCR缓冲液，50～100ng模板，每种引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%为7-deaza-dGTP，10%DMSO，1U Taq DNA聚合酶。反应程序为：95℃预变性5min，95℃1min，65℃1min，72℃2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

    1.4  PCR产物的序列胶银染法检测  取10μl PCR产物加入载样缓冲液于6%序列胶电泳。电泳毕经乙酸固定、AgNO3溶液染色及Na2CO3显示后观察结果。

    1.5  Southern印迹杂交  取5μl PCR产物于6%序列胶电泳，常规电转膜，用5′末端标记法以γ-32P-ATP标记探针PE5.1，经预杂交4h，杂交2h，充分洗膜后常规压片，-70℃放射自显影。

    2  结果

    2.1  湖南省人群中FRAXA位点（CGG）n的多态性及分布频率   用PCR方法分析了299条X染色体。经序列胶测定（图2），Southern印迹杂交法验证（图3），表明（CGG）n的拷贝数在20～40之间(见表1)，频率最高的为28（图1）。 

    图1  299条X染色体的(CGG)n多态性分布图

    表1  湖南省人群中299条X染色体的CGG重复数

    2.2  6%序列胶电泳检测PCR产物  见图2。