图2  15mg/kg组胎鼠大脑皮层神经元细胞中亚单倍体DNA明显增多

    3  讨论

    笔者用TUNEL法检测细胞凋亡。TUNEL法是Gaviel等1992年根据细胞凋亡时DNA断裂的特征而设计的DNA链断端标记技术。它是在末端脱氧核苷酸转移酶的介导下，将生物素化的尿苷三磷酸与DNA链断端结合形成多聚体，再与单克隆抗生物素抗体上多聚体结合。这种结合反应具有特异性，能准确反映DNA断裂的存在，能在单个细胞内观察DNA断端，细胞凋亡发生早期即可用此方法检测出来。通过TUNEL法证明，注射1.5mg/kg小剂量可卡因不能使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，而注射15mg/kg、25mg/kg剂量的可卡因可以使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。

    用流式细胞术评价在凋亡过程中细胞浆失水，核染色质浓缩及减少。几分钟内它可在一个至数千个不等的细胞中得到有价值的数值。从胎鼠脑细胞分布直方图研究分析显示：使用不同剂量可卡因，对胎鼠脑细胞可产生不同的影响，并且证明注射小剂量的可卡因（1.5mg/kg），不能使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，而15mg/kg、25mg/kg剂量的可卡因可以使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。

    可卡因分子量低，并且为两性分子，它被人和动物母体摄取后能迅速通过胎盘屏障进入胚胎中，并可通过血脑屏障到达脑组织中［2］。笔者就是利用可卡因对胎鼠大脑皮层神经元细胞影响的这种特性来进行研究的。在研究中，证明小剂量的可卡因不能使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，大剂量的可卡因可以使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。正如Nassogne等学者所证实［3］，可卡因通过细胞凋亡引起幼鼠大脑皮层神经元的细胞死亡。Cascales也证实可卡因导致一群细胞死亡是通过凋亡程序进行的。笔者通过动物实验更进一步证明这种死亡是通过凋亡程序完成的。

    胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，可能归因于可卡因本身和(或)其代谢产物的作用。可卡因作为一种麻醉剂通过与细胞内的Na+、K+、Ca2+通道结合来干扰这些离子的跨膜运动，而在一些实验中改变胞浆中的Ca2+浓度对于凋亡的早期信号传导起着很重要的作用；可卡因能激活中性鞘磷酯酶，导致神经酰胺积累，通过生化途径诱导凋亡；在胎鼠脑细胞发育的胚胎阶段，可卡因可能激活fos、c-jun 、zif268基因，这些基因已被证实在特定的形式下诱导细胞凋亡［4］。已经证实可卡因代谢期间及由可卡因引起的再灌注的损害期间可产生活性氧（ROS），ROS可激活细胞凋亡，但ROS在组织中的浓度却很难确定［5］。Haikun等研究发现两个相关联的因素：证实还原型谷胱甘肽（GSH）水平的降低以及服用可卡因后过氧化脂的增加，可能与细胞凋亡有关；另外可卡因可以直接作用于组织，产生大量去甲肾上腺素和肾上腺素，导致血管强烈收缩，影响胎鼠脑细胞血供，诱导局部缺血缺氧从而使胎鼠脑细胞凋亡［6］。

    总之，可卡因如何诱导胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡机制有待进一步研究。

    【参考文献】

    1  King T S， Schenken R S.Cocaine disrupts estrous cyclicity and alters the reproductive neuroendocrine axis in rats.Neuroendocrin，1990，51:15.
    2  ZiniA，Abitol J，Girardisk，et al.Germ cell apoptosis and endothelial following nitric oxide synthase(Enos) expression following ischemia -reperfusion injury to testis.Arch Androl，1998，41:57-65.
    3  Nassogne MC，Evrard P，Courtoy PJ.Selective direct toxicity of cocaine on fetal mouse neurons.Ann N Acad Sci，1998，21：51-68，846.
    4  Mitchell ES，Snyder-keller A.Blockade of D1 dopamonergic transmission alleviates c-fos induction and cleaved caspase-3 expression in the brain of rat pppups exposed to prenatal cocaine or perinatal asphyxia.Exp Neurol，2003，182(1):64-74.
    5  Korutla L，Neeustadter JH，Fournier KM，et al.NAC1，a POZ/BTB protein present in the adult mammalian brain，triggers apoptosis after adenovirus-mediated overexpression in PC-12 cells.Neurosci Res，2003，46(1):33-39.
    6  刘剑新，白进良，傅梧，等.在可卡因诱导下大鼠阴茎细胞凋亡与雄激素的关系.中华医学杂志，2001，17：1084-1085.