作者：吴岚莹，王华， 沈朝斌，戴强，孙金平，顾君，夏尤佳，龚建宏

 【摘要】  目的  探讨使用不同剂量可卡因对大脑皮层神经元细胞凋亡的影响。方法  实验组每日分别给妊娠Wistar大鼠皮下注射不同剂量的盐酸可卡因15天。对照组每日给予相同剂量的普通生理盐水15天。在可卡因使用的第15天分别取胎鼠大脑皮层组织，用原位缺口末端标记（TUNEL）法、流式细胞术（FCM）检测大脑皮层神经元细胞凋亡。结果  在使用可卡因15mg/kg和25mg/kg组出现细胞凋亡，同对照组相比差异有非常显著性（P<0.01），而1.5mg/kg组未出现细胞凋亡。结论  使用大剂量可卡因可以导致胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。

    【关键词】  可卡因  神经元  凋亡

    Cocaine induced cell apoptosis in cortical neurons of fetal mice

    【Abstract】  Objective  To investigate the role of cell apoptosis induced by cocaine with different doses.Methods  Pregnant Wistar rats in experimental group were given cocaine hydrochloride with different doses according to body weight(Subcutaneously injected for 15 days). Control animals received physiological saline of equal volumes for 15 days. Cortical tissues of fetal mice were removed after 15 days in two groups. TUNEL (In situ nick end-labelling) assay was carried out to detect cell apoptosis， FCM (flow -cytometry）assay was carried out to detect cell apoptosis in cortical neurons of fetal mice.Results  The number of apoptotic cells was significantly increased in cocaine exposure at doses of 15mg/kg and 25mg/kg ，it were significantly different than the controls (P<0.01).But that at a dose of 1.5mg/kg did not expressed apoptosis.Conclusion  The experimental results suggest that cocaine exposure  at big doses lead to significant apoptosis in cortical neurons of fetal mice.

    【Key words】  cocaine  neuron  apoptosis

    据报道在大多数北美的城市中有6%～15%的孕妇可卡因成瘾，近年来国内一些地区也存在孕妇吸毒问题。虽然可卡因对胚胎大脑的致畸作用已充分阐明，但对神经发育过程中出现的混乱仍存在争议。笔者通过动物实验，探讨使用可卡因对胎鼠大脑皮层神经元细胞的损害。

    1  材料与方法

    1.1  动物分组  将妊娠Wistar大鼠20只，置于室温（20±2）℃的清洁级动物室中，自由进食饮水。将其分成两组：实验组和对照组。实验组共15只妊娠Wistar大鼠，分实验组A、实验组B、实验组C，每组5只妊娠Wistar大鼠。给实验组A、B、C每组大鼠分别皮下注射溶解于0.2ml蒸馏水中盐酸可卡因（青海制药厂）1.5mg/kg、15mg/kg、25mg/kg，后两者为重度可卡因服用者的剂量［1］。每天给每只大鼠称重1次，根据体重调整盐酸可卡因的剂量。对照组5只妊娠Wistar大鼠每天给0.2ml普通生理盐水。此处理持续15天。从每只妊娠Wistar大鼠中分别取出存活的胎鼠3只（死亡除外）。并取大脑皮层组织做检测。每组胎鼠各15只。

    1.2  原位缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡  各组所取组织用10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡切片。原位细胞凋亡检测试剂盒（POD）购自德国BOCKINGER MANNHEIM公司，蛋白酶K为Sigma公司产品，按试剂盒说明进行检测。结果评定标准：凋亡细胞呈棕黄色颗粒状，位于凋亡细胞核内。光学显微镜观察任意10个视野（400倍）并计算凋亡率。

    1.3  FCM测定  分别取实验组和对照组脑组织，制成细胞悬液，于4℃ 1500r/min离心，5min。弃上清，加入溶红细胞液（7g/L氯化铵，2.6g/L Tris-HCl）1ml，4℃ 1500r/min离心，5min。弃上清，加入70%（体积分数）冷乙醇200ml，重悬，于4℃过夜。4℃ 1500r/min离心，5min。弃上清，用0.1mol/L PBS(无钙、镁离子)洗涤1次，加入RNaseA（20g/L），于37℃孵育30min，室温1500r/min离心，5min。弃上清，用PBS重悬，加PI液50μl混合，于室温暗处放置，30min内测定。使用COULTER EPICS-XL型流式细胞仪，光源为氩离子激发器，功率为15mW，激发光波长为488nm，测定10000个细胞，细胞荧光信号被送入脉冲高度分析仪并在荧光屏上显示，同时将测定数据输入PHOENIX FLOW SYSTEMS MULTICYCLE VERSION 4.0进行数据分析。

    1.4  统计学方法  使用SPSS11.0软件，采用t检验。

    2  结果

    2.1  原位缺口末端标记（TUNEL）法检测  大脑皮层神经元细胞凋亡率为：实验组A 5.2%，实验组B 20.6%，实验组C 23.5%，对照组4.5%。实验组A和对照组比较差异无显著性（P>0.05）。实验组B和对照组比较差异有非常显著性（P<0.01），实验组C和对照组比较差异有非常显著性（P<0.01）。表明小剂量的可卡因不能使胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡，大剂量可卡因可以诱导胎鼠大脑皮层神经元细胞凋亡。

    2.2  FCM分析  细胞分布直方图显示，正常脑组织主要由两类细胞组成，按DNA含量排列在相应的峰道数内，故可见如下3个峰。第1个峰为2C峰（二倍体DNA的细胞群），第2个峰为S期的峰，第3个峰为4C峰（四倍体DNA的细胞群）。FCM分析显示对照组和实验组A分布直方图均以2C峰为主，其次为4C峰。在2C峰之前几乎没有明显的细胞分布（图1）。而实验组B、C胎鼠脑细胞分布直方图则有显著改变。在2C峰之前出现一个明显的小峰，为断裂的DNA，代表了凋亡的细胞数量（图2），为亚二倍体的DNA。并且亚二倍体的DNA含量随可卡因剂量不同而变化，见表1。

    表1  分析实验组和对照组中凋亡细胞  (x±s)

                                        注：组间比较：*P<0.05，ΔP>0.05

    图1  对照组胎鼠大脑皮层神经元细胞中仅少量不明显亚单倍体DNA