作者：潘建英，张玉彬，帕它木·莫合买提，肖 萍，沈光祖，金锡鹏

【摘要】  目的   探讨烟酰胺对中波紫外线（UVB）致豚鼠皮肤色素沉着的抑制作用。方法  以亚红斑剂量UVB照射豚鼠背部10天建立皮肤无急性损伤色素沉着动物模型后，外涂基质和2.5%、5%、10%的烟酰胺4周，在此期间观察肤色改变和测定皮肤L值。涂药结束后取材，进行Masson－Fontana、冰冻切片Dopa染色和黑素细胞超微结构观察，观察黑素细胞数量、形态和功能的改变。结果  涂抹5%烟酰胺4周后，豚鼠皮肤变白，L值显著下降，多巴阳性黑素细胞数及黑素含量指数较对照组明显减少（P<0.05）。结论  5％烟酰胺对UVB诱导的色素沉着有明显的抑制，它主要是通过抑制黑素细胞的增殖和黑素细胞内黑素小体的合成而发挥作用。
   
    【关键词】  烟酰胺；色素沉着； 黑素细胞
    
    【Abstract】  Objective   To investigate the inhibitory effect of nicotinamide on hyperpigmentation induced by UVB. Methods   After hyperpigmentation was induced by UVB radiation on the back of brown guinea pigs， substance， 2.5%，5% and 10% nicotinamide were applied on the exposed skin for 4 weeks respectively. During this process， the changes of skin coloration were observed with naked eyes and L value were measured. Then the biopsy specimens were taken from the treated skin， sections were prepared for special staining and TEM examination and the number of melanocytes and melanin content index(MCI) were determined. Results   After the application of 5% nicotinamide for 4 weeks， lightening effect was obviously observed with naked eyes and the L value decreased significantly. Compared with the substance control， the number of Dopa positive melanocytes and melanin content index were all significantly reduced (P<0.05) in the treated skin with 5% nicotinamide. Conclusion  5% nicotinamide is effective in lightening the UVB-induced pigmentation of guinea pig skin. This effect may be related to the declined proliferation of melanocytes and the inhibition of melanin synthesis in melanocytes.
   
    【Key words】  nicotinamide；pigmentation；melanocyte
   
    烟酰胺是近年来尝试用于美白和防晒化妆品中的一种化学物质［1，2］， 但对其效果和作用机制了解甚少。在国内，我们曾应用原代培养的人皮黑素细胞，探讨了烟酰胺抑制黑素合成的适宜浓度［3］，为进一步明确烟酰胺对皮肤色素沉着的抑制作用，本文以棕黄色豚鼠无急性损伤UVB致黑模型评价烟酰胺对皮肤色度的影响，并探讨了可能的作用机制。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  实验动物  体重(355±12)g，健康成年雌性Hartley棕黄色豚鼠10只（上海银根动物养殖场）。
   
    1.2  受试物  carpobol基质；将烟酰胺（分析纯，中国医药上海试剂供应站）溶于carpobol中分别配成2.5％、5％、10％三种浓度。
   
    1.3   动物模型  在豚鼠背部选定4cm×4cm区域脱毛后用TL12Rs型 UV-B灯管（Philips公司）按照16.5mJ/d剂量照射10天，辐照总量为165mJ。照射结束后将产生豚鼠背部皮肤分为4个相离区域，分别外涂carpobol基质、2.5％、5％、10％烟酰胺，每日2次，共计4周。每周用Lab色度仪（CM508d， Minolta公司）测定动物受试皮肤区域L值，涂药结束后，以Powershot S45数码相机（Canon公司）摄影，然后在涂药部位取皮肤做组织学检查。
   
    1.4  肉眼观察  实验期间，每日观察豚鼠皮肤的不良反应，如红斑、鳞屑和色素沉着。
   
    1.5   染色方法  Masson－Fontana染色：按常规方法固定、脱水包埋、脱蜡后，入氢氧化银氨溶液作用12～18h后分别经0.2％氯化金水溶液、5％硫代硫酸钠液处理数分钟。结果：黑素颗粒呈黑色。冰冻切片Dopa染色：新鲜组织低温恒冷切片于0.1％多巴染液中37℃孵育2h，水洗并浅染苏木素、曙红液。结果：活性黑素细胞呈棕黑色。
   
    1.6   组织学观察
   
    1.6.1  多巴阳性细胞计数  在高倍显微镜下（日本Olympus公司），以单盲法计数Dopa切片中每平方毫米表皮基底层所含活性黑素细胞数。
   
    1.6.2  黑素含量指数（melanin content index，MCI）  使用IMS细胞图像分析系统（上海申腾信息技术有限公司）。选择Masson－Fontana切片10处表皮，测定黑素颗粒面积占该处表皮总面积的百分比均值。
   
    1.6.3  电镜观察  在电子显微镜下，观察黑素细胞超微结构变化。
   
    1.7  统计学方法  采用SPSS 11.0统计软件包处理数据，结果用（x±s）表示。用单因素方差分析，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls法。
   
    2  结果
   
    2.1  皮肤外观观察  豚鼠背部皮肤在按16.5mJ/d低剂量UVB重复照射10天期间，未见皮肤潮红、红斑或皮屑等皮肤急性损伤反应，照射14～17天色素沉着达到高峰。涂抹受试物后，豚鼠皮肤均未出现刺激反应。实验结束时，各组皮肤均有不同程度的色素淡化，而5％浓度组皮肤色素淡化最明显见图1。

图1  用药前后，豚鼠皮肤照片A：用药前；B：用药4周a基质对照；b 2．5％烟酰胺；c 5．0％烟酰胺；d 10．0％烟酰胺
   
    2.2  皮肤色度L值改变  Lab仪测定的色度L值是皮肤黑度的量化指标，L值越高说明皮肤越白。皮肤L值变化（△L=L用药后-L用药前）随时间改变，见图2。用药2周时，涂抹基质的皮肤由于UVB的滞后致黑作用L值下降了4.32，而5％烟酰胺组皮肤L值无明显降低，两组具有统计学差异（P<0.05）；用药4周结束时，基质皮肤L值下降了2.88，而相应的5％烟酰胺组皮肤较用药前L值上升了2.03（P<0.01），10%烟酰胺组皮肤L值则上升了1.67（P<0.001）。

图2  烟酰胺对UVB致黑豚鼠皮肤L值改变的影响
   
    （*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）
   
    2.3  光镜观察  见表1。多巴阳性细胞计数和黑素含量指数的结果表明：与基质组比较，5％和10％烟酰胺可以减少表皮基底层黑素细胞数（P<0.05），同时可抑制黑素含量（P<0.05）。但与5％和10％烟酰胺对黑素细胞和黑素合成的抑制作用差异无显著性。

表1  烟酰胺对豚鼠皮肤黑素细胞（MC）和黑素含量的影响  （x±s）

注：与基质对照组相比， *P<0.05
   
    2.4  电镜观察  见图3。基质组皮肤黑素细胞细胞膜完整，胞浆内充斥大量成熟Ⅲ、Ⅳ期黑素小体和少量Ⅰ、Ⅱ期黑素小体，但细胞器较少；2.5%烟酰胺组，黑素小体数量略微减少；在5%烟酰胺组皮肤中，粗面内质网、线粒体等细胞器丰富，Ⅲ、Ⅳ期黑素小体明显减少，散在分布于胞浆中；10%烟酰胺组黑素小体分布与5%烟酰胺组近似。