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3 讨论
3.1 动物实验成模状况 STZ诱导的Wistar大鼠糖尿病动物模型的造模方法是糖尿病动物模型中较为成熟、稳定性好的方法之一［4］。在第8周末，不仅糖尿病成模良好无自然缓解而且12h UAER明显高于正常对照组及3个治疗组糖尿病肾病（incipient ＤＮ）制模成功。光镜下糖尿病对照组可见明显的肾小管上皮细胞的空泡样变性，而肾小球未见结节样或弥漫型肾小球硬化表现，表明糖尿病肾小管损害更早且明显。
3.2 关于实验方法 免疫组化着色结果的判定是免疫组化技术的难题之一。传统的方法是半定量统计分析方法［5］。本研究采用北航图像处理系统，从图片的视野随机采集到最后的测量及计算，全部程序化工作，大大减少了主观失误的概率。阳性面密度描述了阳性目标的着色范围，阳性单位则描述了阳性目标的着色强度，二者乘积综合了面积与强度的综合效应。较以往的半定量结果更客观可靠。每个统计场参数均取3次的均值作为原始数据，强化了结果的稳定性和客观性。
3.3 关于结果的讨论
3.3.1 NF-κB、PDGF- B、PKCα在糖尿病肾损害中的变化及联系 高血糖主要通过3条途径引起细胞损伤。即：非酶糖基化、多元醇通路的激活和DAG-PKC途径的激活。Elisa法证实，在糖尿病大鼠5～20周时的蛋白质的非酶糖化终末产物（advanced glycation end-products，AGEs）在肾皮质中的含量增加10～45倍［6］。糖化的肾小球基膜成分交联明显增多，交联使胶原纤维的直径增大，胶原纤维之间的孔隙增大，使滤过膜大小选择性丧失；另一方面交联的蛋白质与基膜中重要的阴离子蛋白聚糖成分硫酸乙酰肝素的亲和力下降，导致后者清除增多，造成基膜电荷屏障的破坏，所有这些因素均导致了尿蛋白排泄的增加，本研究（表1）UAER的结果已证实这一点。而滤过的白蛋白不仅堆积在系膜区可促进系膜细胞增殖及胞外基质（ECM）的积聚，更重要的是进入肾小管的白蛋白在增加近曲小管上皮细胞重吸收的同时会增加溶酶体活性引起细胞损伤，本研究中的ＨＥ染色结果也证实了这一点。值得注意的是滤过的白蛋白可改变肾小管细胞生物学活性，诱导表达多种细胞因子和细胞介质，其中PDGF-B是重要的一员［7］。Nakagawa等学者的研究发现STZ诱导的糖尿病大鼠在成模后2周、4周及12周时，肾小球部位PDGF-B链及其β受体的表达明显高于对照组和胰岛素治疗组，免疫组化染色表明其不仅分布于系膜细胞，而且也可见于脏层上皮细胞，同时糖尿病组肾小球的体积也明显增加。而且这种早期肾小球异常可以被PDGF系统抑制剂（trapidil）及胰岛素治疗所预防，说明PDGF系统在糖尿病肾病的早期损伤中占有十分重要的位置［8］。本研究糖尿病对照组PDGF-B的染色图片也强烈地证明了PDGF-B在近曲小管的大量沉积和表达，说明PDGF-B明确参与了肾小管间质纤维化的糖尿病损伤过程。余毅等学者的发现与本研究的结果完全一致，但其方法是ABC法，从理论上不如SABC的特异性和敏感性好［9］。
AGEs还可通过与巨噬细胞上特异性受体结合的途径激活细胞因子网络，主要是致炎性细胞因子和生长因子，其中也包括PDGF-B及TGF-β。AGEs与其受体结合后导致细胞氧化张力增加，产生大量的氧自由基，而氧化张力的增高及高血糖引起的高渗透状态均是活化NF-кB的重要因素。NF-κB是一序列特异性的DNA结合蛋白，以非活性形成存在于细胞浆中，不具有细胞特异性。常态下NF-κB的P65亚基与其抑制蛋白IκB结合，覆盖了P50蛋白的核定位信号，形成NF-κB与IκB的复合体。NF-κB在上述因素刺激下其复合物上IκB先磷酸化，然后与NF-κB解离发生核内转位。NF-κB主要介导许多免疫炎性相关因子核转录和表达，导致肾脏局部单核淋巴细胞浸润。本研究中的一抗为P65亚基的抗体，免疫组化染色强烈提示糖尿病第8周末NF-κB的激活状态，肾小球内可见阳性的核着色，近曲小管上皮细胞着色显著强于正常对照组。与文献报道一致［10，11］。这种NF-κB的持续活化是肾小球及肾小管间质纤维化的重要原因。而AgⅡ可直接诱导肾小管间质成纤维细胞的增殖与分化［12］，同时通过AT1受体活化NF-κB，后者又可促进肾小管局部AgⅡmRNA的表达，因此，NF-κB本身的作用与正反馈刺激AgⅡ合成的作用相互叠加共同造成肾小球及肾小管间质纤维化。大多的研究者多关注肾小球的硬化，而忽视肾小管的损伤，如前所述其实肾小管的损伤与AGEs介导的高滤过相伴随。本研究中HE染色结果和PKCα、 NF-κB及PDGF-B在近曲小管的大量着色提示细胞因子和蛋白激酶C系统对糖尿病肾脏肾小管损害的重要意义，近来较多的研究表明，肾小管间质纤维化比肾小球纤维化发生的更早，对肾功能损害意义更大。
NADH的大量产生是DAG-PKC途径活化的主要原因之一。持续血糖升高可激活多元醇通路中分布于肾小球系膜细胞、近曲小管上皮细胞及髓质集合管细胞的醛糖还原酶（AR）基因中的葡萄糖反应元件（glucose response elements，GLRES）及渗透压反应元件（osmotic response element，ORE），从而活化AR，使葡萄糖转变为山梨醇，山梨醇在脱氢酶的作用下转变为果糖，由于山梨醇不易透过细胞膜，而果糖很少进一步代谢，故造成细胞内果糖及山梨醇的堆积引起细胞内高渗状态，导致细胞肿胀破坏。在山梨醇脱氢变为果糖的过程中NAD+变为NADH的产生明显增多。范秋灵等学者的研究以PKC膜转移现象为观察目标［13］（膜转移现象为PKC活化的重要标志）观察了糖尿病SD大鼠2周、4周及12周时PKC活性的动态变化情况，表明2周时PKC的细胞质活性低于正常对照，而细胞膜活性及细胞膜结合PKC的百分比却明显高于正常对照，4周时PKC细胞质活性及细胞膜活性均明显增加，膜结合PKC百分比无变化，而12周时细胞质、细胞膜及膜结合PKC百分比均显著增高，同时伴尿蛋白排泄率的显著增高。目前的问题是哪种PKC亚型在起主要作用，Ishii等在糖尿病肾组织中证实是PKCβ异构体增多，而且选择性阻断PKCβ可明显降低蛋白尿，高滤过及高TGF-β表达，因而大多数学者认为PKCβ亚型可能起主要作用。 但Henry等在转染GluT1的系膜细胞上证实PKCα转录增加达7倍之多，PKCα蛋白表达增加40%，激活型的PKCα增加63%［14］。事实上许多文献报道糖尿病大鼠肾脏的PKCα、β、δ、ε亚型的活性是增加的［15，16］。姚丽等发现STZ诱导的SD糖尿病大鼠成模后2周、4周、12周时肾小球PKCα的表达均呈显著上升且逐渐递增的趋势，相反PKCβI、βⅡ在糖尿病2周时都低于正常对照，4周、12周时才逐渐上升接近正常水平但并未超过正常对照水平［17］。张莉等发现STZ诱导的SD糖尿病大鼠5周末时肾皮质内PKCα mRNA水平增加1.67倍，胞膜相关的PKCα与总PKC的比值明显增高，细胞质的PKCα也高于正常，免疫组化显示糖尿病组近曲小管刷状缘的表达增强尤为突出，系膜区的表达也有一定增强，而正常组PKCα在近曲小管仅见少量表达（刷状缘侧）。研究采用肾小球与近曲小管的混合统计场计算阳性面密度、阳性单位及二者乘积，发现糖尿病组中的PKCα免疫组化染色的3项指标的均值明显高于正常对照。
本课题采用的是肾小球与肾小管分开统计的方法观察PKCα的阳性面密度、阳性单位及乘积，结果支持PKCα在糖尿病大鼠肾损害中活性明显增高的判断，尤其与张莉等学者的免疫组化结果相一致，提示PKCα在糖尿病肾损害中的重要作用。活化后的PKC主要通过6方面参与糖尿病肾损害的发生：（1）参与早期高滤过的形成。（2）参与肾小球毛细血管基膜增厚和ECM进行性积聚(活化raf1磷酸化激酶活化→激活有丝分裂原元件激酶MEK→活化有丝分裂原活化蛋白激酶MAPK→C-fos和C-jun表达↑→AP1样转录因子↑→TGFβ1转录↑)。（3）增加肾小球毛细血管通透性。（4）PKC活化后可促进一些生长因子的表达参与细胞增殖，如：VEGF、PDGF-B，STZ诱导的糖尿病大鼠5天就可见到肾组织内PDGF-B mRNA表达的明显增加；（5）PKC系统活化后可引起NF-κB与细胞质结合蛋白IKB的解离(通过IKB的磷酸化)，使NF-κB活化。（6）参与肾脏局部RAS系统的激活。
3.3.2 药物干预治疗对3种蛋白分子免疫组织化学染色结果的影响及可能机制的讨论 近年来AT1受体拮抗剂、他汀类药物的研究文献颇多，但氯沙坦、辛伐他汀对糖尿病肾脏PKCα、 NF-κB及PDGF-B表达影响的报道不多。尤其是两药联合治疗的免疫组化定量分析报道更为鲜见。
（1）氯沙坦对糖尿病大鼠肾脏PKCα、 NF-κB及PDGF-B表达的作用。氯沙坦（losartan）的作用机制是明显扩张肾小球出、入球动脉，增加肾血流量，降低肾内压，并阻断因AT1受体后过度活化引起的病理生理过程。郑晓静的观察表明，氯沙坦15mg/（kg·d）灌胃的糖尿病SD鼠其肾小球内NF-κB免疫组化的阳性细胞数、黏附分子-1（ICAM-1）的表达及单核细胞数均明显低于糖尿病对照组但未达到正常组水平。
本研究氯沙坦治疗组PKCα表达的显著下降可能是通过抑制血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体1活化后引起的G蛋白或酪氨酸蛋白激酶耦联的磷脂酶C（PLC）/PLD激活所产生的二酰甘油（DAG）的增多而达到抑制PKCα进一步活化的效果。而NF-κB、PDGF-B的下降继发于局部RAS的阻断及PKCα活性的下降。
（2）他汀类药物对糖尿病大鼠肾脏PKCα、 NF-κB及PDGF-B三指标表达的作用。他汀类药物在糖尿病肾病中的机制是基于其抗细胞增殖作用。由于血胆固醇浓度与肾功能减退呈正相关［18］，他汀类药可通过调脂作用改善肾损害的进程，然而该类药对本身无明显高脂血症的残余肾模型同样可延缓肾小球硬化的进展［19］， 表1的结果支持降脂以外的肾保护作用。早在10年前就发现辛伐他汀可抑制PDGF引起的人肾小球系膜细胞DNA合成和细胞增殖，且呈剂量依赖性［20］。李航等学者的观察表明，肾小球系膜细胞在脂多糖（LPS）诱导下的NF-κB的活化及其他炎性细胞因子mRNA的高表达可被洛伐他汀明显抑制，而加入甲羟戊酸及法呢醇则可解除抑制，说明洛伐他汀通过抑制NF-κB活化途径达到抑制炎性细胞因子表达的作用［21］。陈丽萌等学者则观察了洛伐他汀对高糖作用下的人肾小管上皮细胞NF-κB的作用，发现洛伐他汀可部分或全部逆转高糖对肾小管上皮细胞NF-κB的活化并抑制高糖对肾小管上皮培养液中PAI-1活性及相应mRNA表达的刺激作用［22］。他汀类药物对PKCα在糖尿病肾脏中的表达影响的文献尚未查到，但对TGFβ的影响已有大量文献报道，结果并不一致。Ghosh等学者证实辛伐他汀可抑制PDGF诱导的系膜细胞增殖的合成，同时下调系膜细胞表达C-myc、PDGF-B及其受体β亚单位的mRNA，且抑制作用可被外加的甲羟戊酸所逆转［23］。
本课题对PDGF-B用辛伐他汀治疗的肾小球、肾小管免疫组化阳性面密度与阳性单位乘积的统计分析表明，辛伐他汀可明显抑制PDGF在肾小球及肾小管的表达，但均未达到正常对照水平。NF-κB及PKCα在糖尿病大鼠肾脏中的变化与单用氯沙坦的情形相仿。
（3）氯沙坦与辛伐他汀合用的效果。氯沙坦与辛伐他汀合用使 NF-κB在肾小球和肾小管的相应免疫组化指标进一步下降并接近于正常，提示在NF-κB的过度活化问题上两种药物合用的乐观前景；PKCα在肾小球、肾小管免疫组化的结果与NF-κB相近。PDGF-B在肾小球表达的指标也得到进一步改善接近正常水平；提示两药合用在糖尿病肾病的发生发展中有协同作用，但仍达不到正常水平。
综上所述，NF-κB 、PDGF-B 及PKCα在糖尿病大鼠8周时在肾小球及肾小管的表达均明显增强，提示其参与了糖尿病肾病发生发展的过程，药物治疗表明，氯沙坦可明显抑制3种细胞介质的表达，说明局部RAS系统活化的意义，3种介质与肾脏局部的RAS系统过度活化密切相关。氯沙坦与辛伐他汀合用，3种介质的指标均可获进一步改善，说明两类药物具有协同作用。【参考文献】 1 于德民，吴锐，尹潍，等.实验性链脲佐菌素糖尿病动物模型的研究.中国糖尿病杂志，1995，3：105-109.
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