【摘要】 目的 观察链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病Wistar大鼠在糖尿病对照、糖尿病分别用氯沙坦、辛伐他汀以及用辛伐他汀和氯沙坦联合治疗的4种条件下肾脏NF-κB、PKCα 及 PDGF-B表达的情况，以阐明NF-κB、PKCα 及 PDGF-B 在糖尿病大鼠肾脏中的变化和药物作用的可能机制。方法 用放射免疫法测尿白蛋白并计算12h尿蛋白排泄率（UAER），同时测FBG、血胆固醇、血甘油三酯、血肌酐。肾组织切片HE染色镜下观察糖尿病肾脏常规病理变化。用SABC免疫组化方法检测各组肾小球、肾小管NF-κB、PKCα 及 PDGF-B三种蛋白的表达情况。用图像采集分析软件对免疫组化染色情况进行定量分析。结果 （1）糖尿病8周末，NF-κB、PDGF-B及PKCα在肾组织的表达显著增高（与正常对照比P<0.05）。HE染色未见糖尿病肾病特有的结节型或弥漫型肾小球硬化表现，但糖尿病对照组可见明显的肾小管上皮细胞的空泡样变性，而正常或药物治疗组未见相应改变。UAER高达90μg/min以上，明显高于正常对照组（P<0.0001）。（2）辛伐他汀和氯沙坦各自单独治疗均可使以上指标的表达显著抑制（与糖尿病对照比P<0.05），而且辛伐他汀的治疗作用独立于其降脂作用，但均达不到正常对照水平，两药联合使用可使表达水平进一步下降和改善。结论 NF-κB、PDGF-B及PKCα的表达对糖尿病肾病起着重要的作用。氯沙坦的肾脏保护作用不同于脂类代谢的作用、氯沙坦和辛伐他汀的联合应用可以更好地保护肾脏，但它们真正的作用机制有待进一步的研究。
【关键词】 氯沙坦 辛伐他汀 糖尿病肾病 蛋白激酶Cα 血小板衍化生长因子-B链
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【Abstract】 Objective The excessive expressions of TGF-β，VEGF in renal tissue of diabetic rats has been reported recent years， and the changes could be inhibited with losartan and fluvastatin. But exact action mechanism is not very clear. To research the effects of NF-κB、PKCα and PDGF-B on the progression of diabetic nephropathy and the renoprotective mechanism of losartan and Simvastatin on Streptozotocin-induced diabetic Wistar rats， the study item was designed.Methods The 60 Wistar rats were randomly divided into following 5 groups： normal control (n=8，C group)， diabetes control (n=13， D group)， diabetic rats treated with losartan［20mg/(kg·d)， by gavage， n=13，D1 group］， diabetic rats treated with simvastatin［2mg/(kg·d)， by gavage， n=13，D2 group］ and diabetic rats treated with losartan and simvastatin［20mg/(kg·d) and 2mg/(kg·d)， by gavage， n=13，D3 group］.All rats of diabetic groups were not treated with insulin or other anti-diabetes drugs. At the end of the 8th week of study， protein expressions of NF-κB、PKCα and PDGF-B in kidney were measured by immunohistochemistry， and 12-hour urine albuminuria excretion rate(UAER)，plasma cholesterol，plasma triglyceride and plasma creatinine were determined with biochemistry .Results After 8 weeks ，the expressions of NF-κB，PKCα and PDGF-B in diabetic renal tissue were significantly increased(P<0.05). The means of UAER in diabetic control group was also significant different from other groups and was more than 90μg/min . The immunohistochemistry staining of NF-κB，PKCα and PDGF-B in kidney proximal tuble cytoplasma was more than that in glomeruler. Epithelial cells of kidney tuble were found vacuolar degeneration with hematoxylin-eosin staining(HE staining) by light microscopy . Both losartan and simvastatin could significantly inhibit the expressions of NF-κB，PKCα and PDGF-B in diabetic renal tissue(P<0.05)，but could not make it recovery. Combined treatment of losartan and simvastatin could inhibit the expressions of NF-κB，PKCα and PDGF-B further. In general， effects between losartan and simvastatin were not significant difference.Conclusion NF-κB，PKCα and PDGF-B play an important action on the progression of diabetic nephropathy. It shouldn’t be ignored that they might injure kidney tuble . Both losartan and simvastatin have significant effect on diabetic nephropathy. The renoprotective effect of losartan is independent upon it’s effect of regulating lipoid metabolism. Combined treatment of losartan and simvastatin could further protect kidney from diabetic injury. But their exact mechanism remains to be further studied.
【Key words】 losartan simvastatin diabetes nephropathy nuclear factor-kappa B protein kinase Cα isoenzyme platelet derived growth factor-B chain
通过观察NF-κB、PDGF-В、PKCα三种指标在STZ诱导的Wistar大鼠糖尿病对照、糖尿病用氯沙坦治疗、糖尿病用辛伐他汀治疗以及两药联合治疗4种条件下与正常对照大鼠肾小球、肾小管间质的免疫组化着色情况，进一步阐明肾脏局部RAS、PKCα、NF-κB、PDGF-В之间的联系以及氯沙坦、辛伐他汀肾脏保护作用的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器设备
1.1.1 实验动物 正常健康Wistar大鼠60只雌雄各半，体重210～230g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 试剂与相关药品 (1)链脲佐菌素（Streptozotoain，STZ sigma）在低温、酸性条件下进行，现配现用。氯沙坦、辛伐他汀由默沙东公司赞助。(2)免疫组化试剂：全套试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司（Boster）。免疫组化试剂采用即用型SABC试剂盒，产品编号为SA1022。(3)放射免疫试剂盒：采用中国原子能科学研究院的白蛋白测定试剂盒查尿白蛋白排泄率（UAER）。
1.1.3 仪器设备 (1)实验动物房、代谢笼及制模所需物品。(2)切片机、加样器、烤箱、医用微波炉、温箱等。(3)北京麦克奥迪图像技术有限公司的CMIAS系列-多功能真彩色病理图像分析系统，用于免疫组化切片图像分析。SAS 6.12分析软件，用于数据统计学处理。(4)血糖测定采用德国乐康全血糖仪（葡萄糖氧化酶法），血脂、血肌酐测定采用日立7170A全自动生化分析仪。
1.2 方法
1.2.1 动物分组、成模及用药 实验动物在分组前进行尿常规检查以除外实验前潜在的尿蛋白阳性情况。随机分为5组，正常对照组（C组，n=8），糖尿病对照组（D组，n=13）、糖尿病氯沙坦治疗组（D1组，n=13）、糖尿病辛伐他汀治疗组（D2组，n=13）及糖尿病氯沙坦和辛伐他汀联合治疗组（D3组，n=13）。除C组外，其余4组动物在空腹10h（过夜后）后按60mg/kg体重一次性腹腔注射链脲佐菌素溶液，72h后尾静脉采血，用血糖仪测定空腹全血血糖(FBG)，血糖≥16.65mmol/L并持续3天者确认为糖尿病大鼠［1］。实验期间大鼠自由饮水、进食，均不使用胰岛素及其他抗糖尿病药物治疗。每周查尿常规、尿酮体及空腹血糖1次。D1组每日每公斤体重20mg氯沙坦灌胃，D2组每日每公斤体重2mg灌胃，D3组两药合用，用量用法分别同D1、D2组。于成模后第8周末用代谢笼收集12h尿，放射免疫法测定尿白蛋白，同时查各组空腹血糖及血脂、血肌酐指标，全部动物逐个宰杀后取肾脏并反复用生理盐水灌洗后入10%的中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋。
1.2.2 HE染色及免疫组化染色 按常规程序进行HE染色。严格按SABC试剂盒要求进行免疫组化染色。NF-κB及PKCα按推荐条件行微波抗原修复。PDGF-B不用抗原修复直接进入下一步。选糖尿病对照组（抗原表达最丰富）用PBS代替相应一抗作为阴性对照。
1.2.3 切片图像处理及原始数据采集［2］ 免疫组化染色阳性结果判定标准：阳性组织呈棕黄色，阴性部分呈淡蓝色，分布于肾小球系膜细胞的细胞质、胞核、核膜及肾小管上皮细胞的细胞质等部位。用图像采集模块软件，每组切片随机采集30个视野（10～20倍物镜），用组化分析模块软件对每个视野的肾小球及肾小管/间质进行阳性目标分割、视野编辑（去除非组织视野所占空间等）后，得出每个肾小球视野和肾小管/间质视野阳性目标面密度（阳性染色面积/统计场面积）及阳性单位（代表染色部分的平均吸光度，染色越深，数值越大），而阳性面密度与阳性单位之乘积可以反映免疫组化阳性目标的总强度，即抗原的总量。为保证测定数据的准确性，对每个统计场的参数进行3次操作，最后取3次参数的均值作为统计场参数进入统计学分析的原始数据。
1.2.4 统计学分析 (1)成组设计的方法比较正常对照组与其他4组糖尿病鼠血脂及12h尿白蛋白排泄率（UAER）指标，以确认血脂及UAER在实验过程中的变化。(2)NF-κB、PDGF- B、PKCα三种指标肾小球、肾小管/间质免疫组化阳性面密度、阳性单位及其乘积的变化。 数据均用均数±标准差(x±s)表示，使用SAS软件包进行方差分析、q检验、非参数χ2分布概率计算及t检验或t’检验（方差不齐时）。
2 结果
整个实验过程未见糖尿病酮症酸中毒。
2.1 各组之间生化指标的变化 见表1。表1 各组血糖、血肌酐、血脂及UAER的变化 (x±s) 
注：与C组比较：*P＜0.0001（t’检验 ）；与D组比较：ΔP＜0.0001（t’检验）； D1、D2、D3组q检验：#P<0.05(方差分析F：14.67，P<0.0001)
由表1可知，成模后各糖尿病组大鼠空腹血糖水平（FBG）明显高于正常对照组（P<0.0001），而各糖尿病组之间血糖值差异无显著性。各组血脂指标及血肌酐比较差异无显著性。D组UAER在成模后第8周末明显高于正常对照组及糖尿病各处理组(P<0.0001)。在成模后第8周末， D组的UAER水平已达临床微量白蛋白尿的水平［3］。同时糖尿病动物模型成模效果良好，无自然缓解倾向。糖尿病的3种处理方式均可使UAER水平明显下降(P<0.0001)，且联合治疗组的疗效较单药疗效更好(P<0.05)。
2.2 HE染色镜下所见 普通光镜下各组大鼠的肾小球尚未见糖尿病肾病特有的结节型或弥漫型肾小球硬化表现，表明尚处于糖尿病肾病的较早期。但在糖尿病对照组可见明显的肾小管上皮细胞的空泡样变性，而正常或药物治疗组未见相应改变。
2.3 免疫组化染色结果 见表2。
2.3.1 整体免疫组化着色情况 在所有的糖尿病组（D组）染色强度及面积显著增强（P<0.05），其中肾小管着色明显强于肾小球，尤其是近曲小管。阴性对照未见非特异性着色，说明整个免疫组化实验中未受内源性过氧化物酶及生物素影响。糖尿病各处理组的着色面积及阳性单位均明显低于糖尿病对照组。
2.3.２ NF-κB 在C组NF-κB的着色主要分布于肾小球系膜细胞内皮细胞以及肾小管上皮细胞的细胞质中，着色强度微弱。D组的着色强度及面积明显增强，且核内着色明显增多。D1、 D2 、D3组的着色强度、面积均明显低于D组并接近C组(见表2)。 表2 NF-κB、PDGF-B与PKCα在Wistar糖尿病大鼠肾脏的表达 (x±s) 
注：※所有比较组的方差分析P<0.001，且非参数卡方分布作为近似分布所得概率值P=0.0001；q检验：a：与D组比P<0.05，b：与C组比P<0.05，c：与D3组比P<0.05，d：与D1组比P<0.05，e：与D2组比P<0.05
2.3.３ PDGF-B 正常组可见着色主要集中在集合管、远端小管、近端小管细胞质中，肾小球系膜区表达极微量，糖尿病组着色面积及强度明显增大。氯沙坦治疗组优于辛伐他汀组，辛伐他汀对远曲小管PDGF-B表达的抑制较差(见表2)。
2.3.４ PKCα 糖尿病对照组的阳性着色部位主要在近、远曲小管，肾小球系膜区也有明显染色。正常组在近曲小管刷状缘侧、肾小球系膜区亦有表达，但极微弱。糖尿病各服药组的表达强度明显低于糖尿病组并接近正常对照组，尤其是联合治疗组效果更显著(见表2)。3种抗原分子在各组肾组织表达的阳性面密度、阳性单位及面密度×阳性单位数据及统计学处理结果(见表2)。
2.4 统计学分析 (1)表2所示各比较组内的C、D、D1、D2、D3 5个水平的方差分析有极显著性(P<0.001)。(2)q检验表明，几乎各比较组内D组的均数均明显高于其他组（P<0.05），糖尿病鼠的3种用药方式均可达到明显抑制肾组织NF-κB、PDGF- B、PKCα 3种指标表达的效果（P<0.05）。D1与D2的效果基本相当，D2组的数据稍高，但大多数组无统计学意义。D3组的优势主要表现在肾小球PDGF-B阳性面密度与阳性单位乘积的明显抑制以及肾小管NF-κB、PKCα阳性面密度与阳性单位乘积的明显抑制(与D1、D2组比较P<0.05)。(3)各比较组非参数检验用卡方分布作为其近似分布推算出的概率P=0.0001，表明无论肾小球或肾小管，在阳性面密度、阳性单位及二者乘积NF-κB、PDGF- B、PKCα指标在5个水平上的数据分布位置之间的差异具有非常显著性。 |
