S-100是一组可溶性、相对低分子质量、高酸性蛋白，属神经胶质细胞特异性蛋白，亦可存在于神经纤维中。在研究肠神经系统的形态特征及结构特征中，S-100有良好的表达功能［1］。本研究中10例正常对照者肠壁与25例HD患儿扩张段肠壁肌间和黏膜下层均可见S-100阳性染色的神经纤维丛中有细胞状“空白区”，与HE切片比较后发现，细胞状“空白区”总是出现在神经节细胞所处的位置。在25例HD患儿狭窄段肠壁的肌间和黏膜下层中，S-100染色细胞状“空白区”均未观察到。因此笔者认为，S-100染色中出现的细胞状“空白区”是神经节细胞的特征性表现［2］。S-100可作为观察神经节细胞的指标之一。

    CAD是一种天冬氨酸酶，属于溶酶体酸性蛋白酶家族，其在细胞内蛋白质的分解代谢中起着关键作用，可催化许多神经肽的降解，如P物质、生长抑素、B脂蛋白和血管紧张素原。由于CAD在人类脑组织神经元、体内神经节细胞中含量丰富，故可作为肠壁神经节细胞的标记［3］。本研究的结果与其他学者［3，4］报道的一致。即在结肠壁中，CAD的免疫反应性仅局限于神经节细胞，神经纤维和神经胶质细胞均无阳性染色。本组25例HD患儿狭窄段肠壁全部缺乏CAD阳性表达，而10例对照组和25例HD患儿扩张段肠壁均可见CAD染色阳性的神经节细胞。这与常规病理检查结果相一致。说明CAD对神经节细胞具有较高的特异性表达。在新生儿的病例中，CAD的阳性表达同样容易看到。

    组织学研究已经证明，正常人的肠内神经节细胞数目出生后已固定，但有一个成熟过程，即随着年龄增长，大而成熟的神经节细胞数目逐渐增多，不成熟的神经节细胞比例减少［5］。在本研究的结果中观察到，虽然神经节细胞对CAD均为阳性表达，但不同部位的阳性染色程度不一致，表现为神经节细胞胞质中棕黄色颗粒物数量与颜色深度均存在差异。肌间神经丛内神经节细胞染色一般强于黏膜下神经丛。比较HE切片与CAD染色切片还发现，在HE切片中观察到的细胞核大、细胞质丰富的神经节细胞表达CAD较强，而细胞核小、细胞质较少或不明显的神经节细胞对CAD的表达相对较弱。这可能与神经元发育不成熟或发育不良有关［4］。也可以说明染色深浅不同的神经节细胞其成熟程度不同，成熟的神经节细胞染色较深。因此，笔者认为CAD不仅可以作为神经节细胞的特异性标记物，还可以检测肠道神经系统中神经节细胞的成熟程度，作为对临床预后情况评估的指标。对于手术扩张段近端切缘中无CAD表达或神经节细胞CAD阳性表达程度较低的病例，应该密切观察，以免术后并发肠神经发育不良症引起肠梗阻。

    在所有标本的黏膜层和黏膜下层可看到少数CAD弱阳性表达的细胞散在分布。经CD68染色证实为组织细胞。虽然组织细胞对CAD也为阳性表达，但组织细胞与神经节细胞不难鉴别：(1)组织细胞常有长而扭曲的细胞核，缺乏明显的核仁；神经节细胞核大而圆似“枭眼状”，核仁清晰。(2)组织细胞常单个存在或与淋巴细胞同时出现，远离神经丛和神经纤维［3，4］。

    研究结果中神经纤维束异常增生的原因目前还不完全清楚，有学者认为异常增生的神经纤维束可能来自肠壁外的神经组织［2］。虽然这些异常增生的神经纤维束对HD不具诊断性意义，但是如果在病变肠壁的肌间或黏膜下层都找不到这种扭曲粗大的神经纤维束，则诊断HD应该慎重。

    综上所述，CAD是肠神经节细胞特异性较高的标志物，对不同成熟程度的神经节细胞表达强度不同，不仅可以特异性标记神经节细胞，而且可以判断神经节细胞的成熟程度，用于评估预后。S-100对神经节细胞阴性表达可以形成具有特征性的细胞状“空白区”，与CAD的阳性表达对比观察，同时应用，对HD的诊断有较大的帮助。这两种抗体的免疫组化染色均能用于常规固定、石蜡包埋的组织，方法简单，染色结果便于观察与判断，故可作为诊断HD的一种有效的辅   
      
                                 

                                   图1  正常结肠壁肌间神经丛中神经节细胞阳性表达CAD免疫组化两步法  ×400
                                   图2  S-100染色正常结肠壁肌间神经丛中神经节细胞形成细胞状“空白区”
                                          （↑所示） 免疫组化两步法 ×400                             


                                  
    
                           图3  HD狭窄段肠壁肌间可见神经纤维束显著增生，强阳性表达S-100免疫组化两步法×100
                           图4  HD狭窄段肠壁肌间神经纤维束增加、扭曲，强阳性表达S-100免疫组化两步法×400
    
                                                                                   【参考文献】

    1  Krammer HJ，Karahan ST，Siggew，et al.Immunohistochemistry of markers of the enteric nervous system in whole-mount preparations of the human colon. Eur J Pediatr Surg，1994，4(5):274-278.
    2  宓开鸿，李继承，刘伟光.PGP9.5及S-100蛋白在先天性巨结肠中的表达.中国神经免疫学与神经病学杂志，2001，8(2):116-120.
    3  Abu-Alfa AK，Kuan SF，West AB，et al.Cathepsin D in intestinal ganglion cells:a potential aid to diagnosis in suspected Hirschsprung’s disease. Am J Surg Pathol，1997，21:201-205.
    4  Dzienis-Koronkiewicz E，Debek W，Sulkowska，et al.Suitability of selected markers for identification of elements of the intestinal nervous system(INS).Eur J Pediatr Surg，2002，12:397-401.
    5  王夫.先天性巨结肠及其同源病的诊断.中国实用儿科杂志，1997，12(3):134-135.